基因芯片技术

基因芯片技术是一种大规模集成的固相杂交，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作为探针固化于支持物上，将样品进行标记后与芯片杂交，通过检测杂交信号检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的遗传信息。

根据基因芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片（synthetic gene chip）和DNA微集阵列（DNA microarray）。

原位合成芯片的基本原理是采用显微光蚀刻（photolithography）等技术，在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成。这种芯片的集成度较高，但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为8～20个碱基，最长不超过50个碱基。

因此对于一般长度的基因，需要使用多个相互重叠的探针进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。虽然物理集成度高，但生物遗传信息的集成度相对受到影响。并且这类芯片的制备有严格的专利控制，发展受到限制。

DNA微集阵列的基本原理是用一套特殊的芯片打印装置，通过机械臂的来回移动，以显微打印的方式，将预先制备好的基因探针有序地固化于支持物表面。

虽然芯片的集成度相对较低，但使用的探针组来源比较灵活，可是合成的寡核苷酸片段、PCR扩增产物，也可采用来自基因组的DNA片段；可以是双链，亦可采用单链的DNA或RNA片段，且技术实现未受到专利控制，因而目前国际上发展很快。

基因芯片技术常用于DNA序列测定、基因表达分析、基因组研究、基因诊断、药物研究与开发，以及工农业、食品与环境监测等领域。

基因芯片的基本过程可分为如下几步（以反转录法标记样品mRNA后与表达谱芯片杂交为例）：

（一）试剂配制

（1）Tris-HCl (pH 6.5)：称取Tris 242.2 g，加双蒸水1600 ml，加热搅拌溶解，配制Tris母液。取Tris 母液80 ml，用盐酸调节pH至6.5，加双蒸水定容至100 ml，103.4 kPa 灭菌20 min。

（2）5xRT缓冲液 250 mmol／L Tris-HCl（pH 8.3），375 mmol／L KC1，50 mmol／L MgCl2。

（3）预杂交液 25％ 甲酰胺，5xSSC，0.1％ SDS，1％ BSA。

（4）2x杂交液 50％ 甲酰胺，10xSSC，0.2％ SDS。

（5）洗液A 2xSSC，0.1％ SDS。

（6）洗液B 0.1xSSC，0.1％ SDS。

（7）洗液C 0.1xSSC。

（二）DNA微集阵列的制备

（1）探针的制备采用常规分子生物学方法（PCR扩增与基因克隆技术）来制备探针，RT-PCR扩增cDNA。经纯化后，浓度需达到1 μg／μl。

另外需准备阳性对照探针、阴性对照探针以及空白对照探针。在探针中加入DMSO和Tris-HCl（pH 6.5），终浓度分别为：DM-SO，50％；Tris-HC1,20 mmol／L；探针300 ng／μl。

混合均匀后转移至384孔板。盖上盖，95 ℃加热5 min后置于冰上，以备打印。

（2）探针的打印根据探针的数量、每个探针要打印的点数，设计芯片上探针的阵列分布，并编制相应的程序，由芯片打印仪自动完成芯片的打印。

（3）芯片打印后处理

①紫外交联 将芯片置于紫外交联仪中，照射能量为90 mj，使DNA交联在玻片表面。

②固定 将芯片放在玻片盒中，80 ℃干烤2 h。

③干燥、避光保存。

（三）样品的准备

（1）提取组织细胞中的总RNA。

（2）样品的荧光标记。

①在离心管中加10 μg总 RNA，2 μg oligo（dT）18和DEPC-H₂O至总体积14 μl。将上述混合液于70 ℃加热10 min，迅速置冰上冷却1 min，使oligo（dT）18与mRNA退火。

②加入如下成分：5xRT缓冲液，10 μl；DTT（5 mmol／L），5.0 μl；RNA酶 抑制剂（20 U／μl），1.5 μl；dATP、dGTP、dTTP（各25 mmol／L），1.0 μl；dCTP（1 mmol／L）， 5.0 μl；Cy3／Cy5-dCTP（1 mmol／L，Cy3／Cy5分别标记对照和待测），2.0 μl；Superscrpt II 反转录酶（200 U／μl），1.5 μl；总体积至50 μl。

③混匀，42 ℃温育2 h，使 polyA化的 mRNA 进行反转录。

④简短离心，加1.5 μl 20 mmol／L EDTA终止反应。

⑤加2.5 μl 500 mmol／L NaOH，70 ℃加热 10 min 降解 RNA。

⑥加2.5 μl 500 mmol／L HCI 中和 NaOH。

⑦加入5 μl 3 mol／L NaAc，75 μl无水乙醇。

⑧-20 ℃放置20 min，高速离心15 min，以沉淀cDNA。

⑨弃上清液，用0.5 ml 70％ 乙醇清洗沉淀。

⑩在高速真空机中干燥沉淀。

加入10 μl灭菌去离子水溶解，测定样品的OD260。

（四）分子杂交与杂交后清洗

（1）预杂交

①小心从玻片盒中取出芯片，放入预杂交液中，42 ℃温育1 h。

②在灭菌水中过5遍。

③浸入异丙醇1 min，空气干燥。

（2）杂交

①盖玻片的处理用灭菌水冲洗后，再用无水乙醇冲洗，硅烷化，空气干燥。

②样品处理将纯化的Cy3和Cy5标记探针各取适量混合，使样品的终浓度均为100 ng／μl，然后加入Cotl DNA（20 μg／μl）1 μl轻轻混匀后，95 ℃加热5 min，高速离心2 min。

③将探针与等体积、42 ℃预热的2x杂交缓冲液混合，取4μl处理过的样品点在阵列上。

④小心盖上盖玻片（避免气泡产生）。

⑤在杂交盒两端的小孔中各加10 μldH₂O，保持杂交湿度。

⑥将芯片装进杂交盒，放入42 ℃水浴，杂交16～20 h。

（3）杂交后清洗

①从杂交盒中取出芯片（勿揭开盖玻片）。

②把芯片浸入洗液A，应使盖玻片迅速离开玻片，42 ℃轻轻摇晃5 min。

③将芯片转移至洗液B，室温轻轻摇晃10 min。

⑤重复步骤④4次。

⑥灭菌水清洗，不超过10 s。

⑦浸入无水乙醇。

⑧空气干燥，准备扫描。

（五）芯片的扫描

（1）用美国Gsi Lumonics公司的ScanArray Lite 基因芯片扫描仪扫描芯片，并通过Quan-tArray软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。

①Cy3和Cy5信号的比值的自然对数的绝对值＞2.0（基因的表达差异在2倍以上）。

②Cy3和Cy5信号值其中之一必须达到700以上。

（3）进行大规模基因表达的分析时，还要对这些数据进行统计学分析，如采用聚类分析（cluster analysis）的方法，通过建立各种不同的数学模型，将抽象的数据结果转化为直观的树形图，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能或发现新的基因等。

（六）实验结果及分析

双色荧光扫描图像分别显示Cy5和Cy3标记的探针与芯片杂交的结果，颜色的深浅表示杂交信号的强弱。

将Cy3和Cy5扫描图像完全重叠后，并赋以伪色（Cy5图像以绿色表示，Cy3图像以红色表示）成为双探针杂交的结果图，其中绿色表示高表达，红色表示低表达，黄色表示表达水平无改变。

（1）DNA探针在打印前通常需要进行纯化，以去除酶、离子、dNTP等物质。纯化产物干燥后重新溶于高盐溶液或其他变性缓冲液如3xSSC等。

扩增的探针溶于50％ 二甲基亚砜（DMSO）而不用SSC来溶解，可取得较理想的杂交效果。

因为DMSO可使DNA探针变性并更好地与玻片结合，提供更多单链与靶DNA杂交；而且DMSO具有吸湿性，其蒸气压较低，使DNA探针溶液在打印过程中无显著蒸发，从而能保存更长时间。

（2）对照组探针包含阳性对照和阴性对照基因片段及空白对照。

设立阳性对照的目的是让不同样品的靶基因与该对照杂交后得到的信号基本相同，也就是说，在检测分析时，可以阳性对照的杂交信号作为内对照进行校正（即标准化处理）。

选择阴性对照时应避免与所研究的基因有同源性，从而不至于产生杂交信号，但要求核酸的性质［如长度、（G＋C）含量等］基本相似；空白对照中则不含任何基因，只含溶解上述这些探针的液体（即点样液）。

（3）打印前需对玻片进行表面化学处理，使玻片表面衍生出氨基、醛基、异硫氰酸基等活性基团。

这些活性基团可与DNA分子中的磷酸基、氨基、羟基等基团形成离子键或共价结合，使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面，以防止在杂交时被洗脱。

而且玻片表面经处理后，可减少亲水性的探针在其表面的扩散，因而提高了点阵的打印密度。打印后也要对玻片进行处理，把DNA固定在玻璃表面；同时也需要封闭玻片上未打印的区域，以防止样品DNA的非特异性固定。

（4）在正式打印前，还需先进行预打印，以消除初始所点探针量彼此间不等的差异。

（5）样品经标记后通常还需要进行纯化，才能进行杂交，否则检测时荧光背景高，对杂交信号的检测产生不利的影响。

为保证芯片检测的灵敏度，须特别注意样品 RNA的提取、纯化、反转录标记等环节，其质量和效率决定了芯片检测的实际灵敏度。

（6）芯片的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相似，先进行预杂交。

预杂交时可将玻片上的自由氨基或醛基等活性基团封闭或失活，否则标记的样品靶DNA会与玻片上探针外的其他位点发生非特异性结合，从而消耗靶DNA并产生强的背景。

此外还可以洗掉未结合的DNA探针。

（7）影响芯片杂交的因素包括杂交的温度、探针的序列组成、探针的浓度、靶基因序列的浓度及杂交液的组分等。

基因表达谱芯片杂交时，需要较长的时间（往往要求过夜杂交），高盐浓度、高的样品浓度、较低的杂交温度，但严谨性要求较低，这有利于提高检测的特异性、保证较高的灵敏度并可检测出低拷贝的基因。

杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤，洗去未杂交的一切残留物。杂交和洗脱的条件都必须通过实验进行优化，以保证特异性。

（8）在进行芯片的清洗时，盖玻片开始滑落如果芯片被暴露在空气中，易产生高背景的荧光信号；如果盖玻片在30 s内未滑落，用镊子将其轻轻从芯片表面移除，未移除盖玻片可能降低杂交的效率。

（9）基因表达谱分析时必须对微阵列上阳性杂交点的荧光强度进行处理、分析才能鉴定出差异表达的基因。第一步就是对每个扫描波段的相对荧光强度进行标准化处理。

标准化就是校正荧光标记物的标记效率和检测效率之间的差异。这些差异可导致Cy5和Cy3平均比值的波动。因此在分析前就必须对荧光强度进行校正。