流式细胞仪法分选法分离纯化 CD34＋CD38-Thy-1-的急性粒细胞白血病干细胞
相关实验：肿瘤干细胞的分离纯化
别名：fluorescence-activated cell sorting，FACS，荧光激活细胞分选法
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简介
分离肿瘤干细胞的主要思路与分离成体干细胞的思路类似，包括根据特殊的表面标记分子进行分选和 SP 细胞分离。
原理
荧光激活细胞分选法分离纯化肿瘤干细胞的原理是携带荧光素标记的待检细胞混悬在一定容积的上样缓冲液中，进样后仪器将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。荧光标记的细胞通过仪器的激光束激发照射时，产生的荧光信号通过敏感的光电倍增管被光学系统检测到，并输送到计算机进行分析处理。
材料与仪器
器材：
① 流式细胞分选仪
② 一次性无菌移液管
③ 15 ml 和 50 ml 离心管
试剂：
① 淋巴细胞分离液（Ficoll-hypaque，密度为 1.077 g/ml）
② 肝素，4000 U
③ 1xHBSS
④ 青霉素
⑤ 链霉素
⑥ 胎牛血清
步骤
流式细胞仪分选法的基本过程可分为如下几步（以 CD34＋CD38-Thy-1- 的急性粒细胞白血病干细胞为例）：
（一）试剂配制
（1）血制品保存液的配制 TC199,100 ml；肝素，4000 U；青霉素（10000 U/ml），4 ml；链霉素（10000 μg/ml），4 ml。用 0.22 μm 滤器过滤除菌，每份 5 ml 分装，4 ℃ 保存，1 个月内使用。
（2）流式洗液的配制 1xHBSS，200 ml；胎牛血清，4 g。用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，1 个月内使用。
（二）开始前准备
（1）AML 患者的外周血可在 4 ℃ 保存，24 h 内分离。
（2）D-Hanks 液或生理盐水，室温。
（三）细胞分选
（1）取 AML 患者的外周血 5 ml，与 5 ml 无菌保存液混匀，立即送实验室分离单个核细胞。
（2）加 10 ml 室温 D-Hanks 液或生理盐水稀释外周血。
（3）取 Ficoll-hypaque（有成品供应，密度为 1.077 g/ml ± 0.001 g/ml）3～4 ml，放入 15 ml 离心管中。
（4）将稀释后的外周血沿试管壁缓缓加入，使稀释血液重叠于分层液上，稀释的血液与分离液体积比例约为 1:1～2:1。注意：一定要细心，动作要轻，避免冲散分层液面或与分层液混合而影响分离结果。
（5）用水平离心机以 300 g 离心力，室温离心 20 min。
（6）离心后管内容物分为三层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和多核细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个细胞层，呈白膜状。用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁边缘吸取界面层单个核细胞，移入 50 ml 试管中。
（7）加入 5 倍以上体积 D-Hanks 液，混匀，200 g 离心 10 min。
（8）吸弃上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团，加 20 ml D-Hanks 液，200 g 离心 10 min。
（9）步骤（8）重复一次。
（10）吸弃上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团，加 20 ml 流式洗液，200 g 离心 10 min。
（11）将细胞置于冰上，用流式洗液按 106 个 / 100 μl 的细胞浓度重悬。
（12）细胞染色：加入 Cy5 标记的抗人 CD34 抗体，PE 标记的抗人 Thy-1 抗体和 FITC 标记的抗人 CD38 抗体，抗体浓度根据产品说明书的要求确定。
（13）冰上避光放置 30 min。
（14）200 g 离心 10 min。
（15）去除上清液，轻轻拍散细胞团，加 10 ml 流式洗液，200 g 离心 10 min。
（16）步骤（15）重复一次。
（17）用适当体积（106 个细胞 / 0.5 ml）的流式洗液重悬细胞，按终浓度 2 μg/ml 加入碘化丙锭（PI），置于冰上，避光，待上机。
（18）流式细胞仪分选，根据 PI 摄取量去除死细胞后，根据荧光强度分选 CD34＋CD38-Thy-1- 细胞亚群，分选出的细胞用含有 50％ FCS 的 IMDM 培养基重悬。
（19）分析纯度，通常要求在 95％ 以上。将分选得到的细胞接种培养或进行相关生物学检测。
（20）根据分选结果 CD34＋CD38-Thy- 细胞比例可以得到肿瘤干细胞的比例。
（21）肿瘤干细胞分离后，需要进行一系列的生物学鉴定，以确定分离得到的这部分细胞具有普通肿瘤细胞所不具备的自我更新和分化能力。
（四）实验结果及分析
对分选获得的细胞进行细胞计数，并进行肿瘤干细胞生物学鉴定。
注意事项
（1）分离外周血单个核细胞吸取白膜层时，应避免吸出过多的上清液导致血小板污染，或过多的分层液导致细胞获得率下降。本法分离单个核细胞纯度可达 95％，细胞获得率可达 80％ 以上，得率的高低与骨髓液的稀释、白膜层的吸取及室温有关，室温超过 25 ℃ 时会影响细胞获得率。
（2）整个流式细胞分选前的细胞染色过程中，注意冰上操作，以最大限度地保持细胞活性；整个过程注意避光；若分离得到的细胞还要进行无菌培养，在整个操作过程中要注意无菌。
来源：丁香实验
