• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        透射电镜观察法检测巨自噬

        相关实验:巨自噬检测实验

        最新修订时间:

        简介

        在超薄切片上能够清晰地观察到自噬结构的形态和构造,故透射电镜观察法检测巨自噬是细胞自噬研究的常用技术。

        原理

        在超薄切片上能够通过透射电镜清晰地观察到自噬结构的形态和构造。

        材料与仪器

        器材:离心机、烘箱、切片机、透射电镜、细胞或组织。

        试剂:PBS; 消化液(0.125% 胰蛋白酶;标本处理试剂(2.5% 戊二醛、1% 锇酸、0.1 mol/L 磷酸漂洗液等);乙醇;丙酮,树脂,醋酸双氧铀,枸橼酸铅。

        步骤

        1、用 PBS 浸洗细胞 2 次,然后经 0.125% 胰蛋白酶消化收集细胞,离心(1 000 r/min,5 min)。

        2、吸去上清液,加入 2.5% 戊二醛,在 4 ℃ 条件下预固定细胞 2 h。如为组织样本,将组织切成 1 mm 3 小块,用同样方法预固定。

        3、用 0.1 mol/L 磷酸漂洗液浸洗细胞团或组织块 3 次,每次 15 min。然后,在 50%、70%、90% 乙醇中逐级脱水,各 15 min。

        4、在 4 ℃ 条件下用 90% 乙醇和 90% 丙酮混合液(1:1)置换乙醇,再用 90% 丙酮置换,各 15 min。

        5、在室温下用纯丙酮置换 3 次,每次 20 min。

        6、用 0.1 mol/L 磷酸漂洗液浸洗 3 次,每次 15 min。

        7、用 1% 锇酸固定 2~3 h。

        8、用 0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗 3 次,每次 15 min。

        9、将标本放入纯丙酮和 Jpurr 树脂(2:1)混合液中浸透,室温条件下放置 3 h。然后,在纯丙酮和 Jpurr 树脂(1:2)混合液中过夜。

        10、在 37 ℃ 条件下,Jpurr 树脂中放置 2 h。

        11、37 ℃ 烘箱中过夜,45 ℃ 烘箱中放置 12 h,最后在 60 ℃ 烘箱中放置 24 h。

        12、用超薄切片机作超薄切片,然后用 3% 醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色。

        13、在透射电镜下观察细胞内的自噬结构。

        注意事项

        1、需将自噬前体与内质网和吞饮泡鉴别。在晚期自噬溶酶体自噬体膜被降解,不易将其与异噬溶酶体区别。
         
        2、超薄切片上反映的细胞自噬水平和自噬结构分布较局限,不能从细胞整体上反映自噬结构变化。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序