TRAP检测法检测端粒酶活性

相关实验：端粒酶活性检测实验

别名：te-lomerase repeat amplification protocol，TRAP

最新修订时间：2022-02-10

简介

1994，Kim 等人发明了名为端粒酶重复扩增技术（te-lomerase repeat amplification protocol，TRAP）的检测方法，实现了端粒酶活性检测的重大突破，并使之成为到目前为止应用得最为广泛也最为公认的端粒酶活性检测方法。

原理

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本原理是通过具有活性的端粒酶催化，将端粒重复序列（GGTTAG）加到一个寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，然后通过 PCR 扩增 30～33 个循环，通过在反应中的 TS 引物上引入放射性同位素 y-32P-ATP 标记，对 PCR 产物采用聚丙烯酰胺电泳检测，最后采用放射性自显影检测并分析扩增结果。

另外也可以不对引物进行放射性同位素标记，而是采用非放射性的 SYBRGreen 染料对 PCR 产物进行染色鉴定，分析并量化出端粒酶的活性。

材料与仪器

器材：

① 组织研磨器

② 紫外分光光度仪

③ PCR 仪

④ 垂直电泳槽

⑤ 紫外凝胶成像系统

⑥ 待测细胞或组织样品细胞。

试剂：

① 聚丙烯酰胺凝胶试剂

② Taq DNA 聚合酶;

③ dNTP Mix。

④ SYBR Green 染料

⑤ TRAP 检测法引物（包括 TS引物，RP引物，K1引物，TSK1引物）;

⑥ 1x CHAPS 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCI，pH7.5，1 mmol/L MgCl_2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L 苯甲脒，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5％ CHAPS，10％丙三醇）

⑦ 10x TRAP 反应缓冲液（200 mmol/L Tris-HCI（pH8.3），15 mmol/L MgCl₂，630 mmol/L KCI，0.5% Tween-20，10 mmol/L EGTA）

步骤

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本过程可分为如下几步：

A 细胞或组织的处理，收集细胞，采用 1x CHAPS 缓冲液在冰上匀浆裂解细胞，冷冻离心分离上清液，测定提取上清液的蛋白浓度后，调定模板浓度为固定值，用于下一步检测。

B TRAP 反应设置，在每个反应中加入模板 2 μl，10x TRAP 反应缓冲液 5 μl，50x dNTP Mix 1 μl，TS引物 1 μl，TRAP 检测法引物（含 RP引物，K1引物，TSK1引物）1 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，ddH₂O 39.6 μl。

C PCR 扩增，PCR 反应条件为：30 ℃ 孵育 30 min，然后进行两步 30 个循环，包括 94 ℃ 变性 30 s，59 ℃ 退火／延伸混合 30 s。反应实际是一个共同缓冲液，双酶系统的反应，在第一个酶系统的反应中，端粒酶将一定数量的端粒重复序列（GGTTAG）转到了寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，而在第二个酶系统的反应中，TS 和 RP引物则可以扩增出一个以 6 碱基递增的产物梯度，如从 50 个核酸开始的：50，56，62，68•••••片段。

D 反应产物电泳及显色反应，将 PCR 反应产物上样到 10％聚丙烯酰胺凝胶中，1x TBE 缓冲液电泳，1:10000 SYBR Green 对凝胶进行染色 15 min 后拍摄照片。

注意事项

1 1x CHAPS 缓冲液裂解细胞应在冰上进行，组织样品比较难于裂解，可能需要用到电动匀浆器，注意应在冰上研磨，避免温度过高，离心应采用冷冻离心机以防止端粒酶遇热降解。

2 采用 SYBR Green 染色时间不应过长，染色应避光进行，拍摄时间不应过长，以防荧光染料见光分解，无法获得清晰图像。

来源：丁香实验