端粒酶活性检测实验

实验分类：

细胞实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

端粒酶是一种能够以自身 RNA 为模板合成端粒 DNA 的反转录酶，通常认为，端粒酶由蛋白部分以及 RNA 部分构成，RNA 部分（telomerase RNA，简写成 TR 或 TERC）是端粒合成的模板，其蛋白部分至少包括两个亚基，大亚基为端粒酶反转录酶（telomerasereverse transcriptase，TERT），其内部具有底物--端粒的结合位点，dNTP 结合的催化位点以及模板排列的位点。

小亚基蛋白由 dyskerin（DKC1）及其他在 TR 处理过程中与装配成具有活性的端粒酶相关 H＋ACA 盒成员等小的核仁复合物组成，端粒酶催化端粒合成的示意图如图 11-7 所示。

由于 TR 和 TERT 是端粒酶的活性基团，因此端粒酶的活性示与检测通常是通过检测 TR 及 TERT 的活性实现的，对于 TR 表达水平的检测通常可以采用定量 PCR 等方法，但由于 TR 实际上并非端粒酶活性的限速因子，因而检测端粒酶活性的研究主要针对检测 TERT 的活性而设计。

传统上 TERT 的活性大致可以通过 3 种方法进行测定：即 PCR 技术、原位杂交技术、免疫荧光／免疫组化／免疫印迹技术。目前，用于端粒酶活性检测实验的方法主要有 1 种：TRAP 检测法。

端粒酶活性检测实验

原理

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本原理是通过具有活性的端粒酶催化，将端粒重复序列（GGTTAG）加到一个寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，然后通过 PCR 扩增 30～33 个循环，通过在反应中的 TS 引物上引入放射性同位素 y-32P-ATP 标记，对 PCR 产物采用聚丙烯酰胺电泳检测，最后采用放射性自显影检测并分析扩增结果。

另外也可以不对引物进行放射性同位素标记，而是采用非放射性的 SYBRGreen 染料对 PCR 产物进行染色鉴定，分析并量化出端粒酶的活性。

来源：丁香实验团队

操作方法

TRAP检测法检测端粒酶活性

1994，Kim 等人发明了名为端粒酶重复扩增技术（te-lomerase repeat amplification protocol，TRAP）的检测方法，实现了端粒酶活性检测的重大突破，并使之成为到目前为止应用得最为广泛也最为公认的端粒酶活性检测方法。