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        基于易错 PCR 产生随机突变体

        相关实验:体外基因随机突变

        最新修订时间:

        简介

        易错 PCR (error-prone PCR ) 是产生随机突变体的另一常用方法,通过改变传统 PCR 反应体系中的 Mg2+ 浓度、dNTP 的浓度比例、pH,或使用低保真度的 Taq DNA 聚合酶,在 DNA 序列扩增中随机引入错误碱基,建立含突变序列的文库。是目前最常用的随机突变方法。


        原理

        易错 PCR 法的基本原理是通常采用缺乏 3'→5 ' 外切核酸酶活性的低保真 DNA 聚合酶扩增基因,从而产生较高的复制错误率(0.8x10-4~1.1x10-4 碱基替换/碱基对)。此外,改变 PCR 反应条件也可以增加错误率,常见的措施有:

        ①提高反应体系中的 Mn2+ 浓度,使得碱基配对的特异性降低;

        ②调整各种 dNTP 的比例,使碱基错误掺入率增加;

        ③提高反应体系中的 Mg2+ 浓度,使非互补配对碱基的稳定性增加;

        ④提高反应体系中的 DNA 聚合酶浓度,使错误合成的 DNA 链末端得以延伸。

        易错 PCR 产物(含各种随机突变序列)随后克隆至适当的载体以构建突变文库。值得注意的是,如果克隆的效率不高,突变文库的规模会受到一定限制。





        材料与仪器

        试剂:
        引物、DNA 聚合酶、模板
        仪器:
        PCR 、电泳仪


        步骤

        易错 PCR 法产生体外突变体的基本过程主要分为以下几步:
        1.采用易错 PCR 使靶基因产生随机突变;
        2.突变的 DNA 序列插入适当的表达载体,转化宿主细胞并表达;
        3.对突变进行筛选鉴定;
        4.对突变基因表达产物进行纯化及功能分析。


        来源:丁香实验

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