简介
脉冲一示踪标记法 (pulse- chase labelingasy) 是用核素或其他标记物标记细胞或生物个体的特定代谢物，通过自显影等方法追踪分析某一代谢过程的技术。例如，用放射性核素标记氨基酸，可检测某种特定蛋白质在细胞内的变化过程。
原理
脉冲追踪标记法的基本原理是在细胞培养基中加人放射性核素标记的氨基酸，如 35 S 标记的甲硫氨酸，期孵育后，该氨基酸掺人合成的蛋白质中；去除培养基中游离的放射性氨基酸，再以饱和量的未标记氨基酸取代；更换培养基，在不同时间裂解细胞，通过免疫沉淀对待测蛋白质进行追踪，放射性核素的衰变率代表检测蛋白质的降解率。
用途
脉冲追踪标记法是研究哺乳动物细胞蛋白折叠、成熟以及降解的有效方法，通过与免疫共沉淀结合可检测特定蛋白质的半衰期。这种方法已经成功用于多种内源性蛋白的分析，如 IgA、甲状腺球蛋白的研究。
材料与仪器
试剂：
①[35 S]-L - 甲硫氨酸 (>296 MBq/mmol)；
②脉冲标记培养液，不含甲硫氨酸的 DMEM 或者 RPMI1640，含 10%(v) FBS；
③追踪培养液，含 15 mg 甲硫氨酸的完全培养液；
④裂解液，PBS (pH74)，包含 0.5%(v/v) Triton X-100、 1 mmol/L EDTA、2 mol/L NEM 以及 1 mmol/L PMSE 和 Cocktail 蛋白抑制剂。
步骤
脉冲追踪标记法的基本过程可分为以下几步，本方法以检测培养的贴壁细胞为例介绍脉冲追踪标记技术的全过程。
细胞的 [35 S]-L-甲硫氨脉冲标记
A. 用的培养培养贴壁细胞 80％～90％ 融合。
B. 用 37℃ 预温的脉冲标记培养液制 [35 S] 一 L 一甲硫氨酸工作液，终浓度为 3.7～7.4 MBq/ml。
C. 去除培养液，用 10 ml 预温的脉冲标记培养液洗细胞 2 次，弃上清。
D. 加 5ml 预温的脉冲标记培养液，37 ℃，5％ CO2 中孵育细胞巧 10～30 min，以消耗去除细胞内的甲硫氨酸。
E. 去除培养液，加入 2 ml [35 S]-L - 甲硫氨酸工作液，37℃，5％ CO2 中孵育细胞 10～30min。
F. 去除上清，加人 10 ml 预温的追踪培养液冼细胞 1 次。
G. 加 10 ml 培养液于 37 ℃，5％ CO2 条件、孵育细胞至不同的追踪时间后，常规刮取细胞。
H. 收集细胞悬液到巧离心管，于 4℃ 300g 离心 5min，去除上清。
l. 用 2 ml 预冷的 PBS 洗 1 次，离心弃上清，加入裂解液，4 ℃，16000 g 离心 10 min，转移上清，并保存于液氮或 -80 ℃ 冰箱中。
注意事项
1. 应在预装有碳过滤器的特通风橱中完成 [35 S]-L-甲硫酸脉冲追踪标记的实验，避免将含放射性的溶液暴露到空气中、并严格遵守其他放射性物质用规则。
2. 放射性标记的氨基酸溶液在标记过程中容易挥发，请将其容器拧紧放置于 37 ℃ 水浴，但不宜超过 1 h。
3. 放射标记的氨基酸可回收重新检测放射性再利用，该反应液可冻于 -20 ℃ 放置 2 个月。
4. 废弃的培养液以及洗液都具有放射性，丢弃应注意安全环保。
来源：丁香实验
