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蛋白质半衰期测定
实验分类：
蛋白质实验
最新修订时间：
简介
蛋白质的半衰期即蛋白质降解一半所需的时间，是用以衡量蛋白质稳定性的基本指标，蛋白质半衰期越长表明蛋白质在细胞内越稳定。目前，用于测定蛋白质半衰期的方法主要有两种：脉冲追踪标记法和放线菌酮阻断法。
原理
脉冲追踪标记法的基本原理是在细胞培养基中加人放射性核素标记的氨基酸，如 35S 标记的甲硫氨酸，期孵育后，该氨基酸掺人合成的蛋白质中；去除培养基中游离的放射性氨基酸，再以饱和量的未标记氨基酸取代；更换培养基，在不同时间裂解细胞，通过免疫沉淀对待测蛋白质进行追踪，放射性核素的衰变率代表检测蛋白质的降解率。
放线菌酮阻断法的基本原理是应用放线菌酮阻断细胞合成新蛋白，于一定时间后收集细胞裂解液，提取总蛋白进行 SDS-PAGE 和免疫印迹。根据免疫印迹的半衰期结果的灰度扫描密度值计算出待测蛋白质的半衰期。
应用
脉冲追踪标记法的常用研究如下：
是研究哺乳动物细胞蛋白折叠、成熟以及降解的有效方法，通过与免疫共沉啶结合可检测特定蛋白质的半衰期。这种方法已经成功用于多种内源性蛋白的分析，如 IgA、甲状腺球蛋白的研究。
放线菌酮阻断法的常用研究如下：
尤为适用于一些难以进行代谢标记的蛋白质半衰期的测定。
来源：丁香实验团队
操作方法
脉冲一示踪标记法 (pulse- chase labelingasy) 是用核素或其他标记物标记细胞或生物个体的特定代谢物，通过自显影等方法追踪分析某一代谢过程的技术。例如，用放射性核素标记氨基酸，可检测某种特定蛋白质在细胞内的变化过程。原理脉冲追踪标记法的基本原理是在细胞培养基中加人放射性核素标记的氨基酸，如 35 S 标记的甲硫氨酸，期孵育后，该氨基酸掺人合成的蛋白质中；去除培养基中游离的
放线菌酮阻断法测定蛋白质半衰期放线菌酮 (cycloheximide) 是一种真核生物蛋白质合成抑制剂，它通过抑制蛋白质合成过程的移位步骤阻止翻译的进行。原理放线菌酮阻断法的基本原理是应用放线菌酮阻断细胞合成新蛋白，于一定时间后收集细胞裂解液，提取总蛋白进行 SDS-PAGE 和免疫印迹。根据免疫印迹的半衰期结果的灰度扫描密度值计算出待测蛋白质的半衰期。用途放线菌酮阻断法尤为适用于一些难以进行代谢标记的蛋白质半衰期的测定。
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