• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        🔥 流式细胞术检测细胞周期

        别名:细胞周期,流式细胞

        最新修订时间:

        简介

        流式细胞周期检测是一种常见的检测细胞增殖情况的方法,细胞在不同周期时,其内的 DNA 含量不同。碘化丙啶(PI)作为一种核酸嵌入型染料,能够进入固定后的细胞中,与细胞内的核酸结合,其荧光强度与 DNA 含量成正比。

        原理

        通过流式细胞仪检测不同细胞中的荧光强度,从而判定不同组别中细胞周期发生的变化。

        用途

        检测不同组别或处理对某种细胞周期的改变。

        材料与仪器

        【器材】流式细胞仪、移液器、枪头、离心管、离心机、水浴锅、流式管、滤头;
        【试剂】0.25% 胰蛋白酶溶液、PBS、RNA 酶、PI 染液、70% 乙醇溶液(建议提前放入负二十度预冷);

        步骤

        以肿瘤细胞为例:

        • 将正常生长的对照或处理组肿瘤细胞计数,每组取 2×105-3×105 个细胞铺板,待细胞贴壁后,将正常培养基替换为无血清 1640 培养基,同步 20 h,使得所有细胞都进入相同的细胞周期时期;同步完后,将培养基重新替换为正常含血清培养基,继续培养 24 h;
        • 用不含 EDTA 的胰酶将细胞消化,收集细胞,300g,离心 3 min;用吸引器去除培养基,用 PBS 清洗细胞一次,再次300g,离心 3 min;去除 PBS,用提前预冷的 70% 酒精重悬细胞沉淀,4℃ 固定过夜;
        • 4℃,1000g,离心 3-5 min,去除酒精,用 PBS 清洗 3 遍,最后一遍去除 PBS;加入 300 μL PBS,轻轻吹打,重悬细胞沉淀,加入相应量的 Rnase 至终浓度 100 μg/mL,37 ℃ 水浴锅中消化 30 min;
        • 上机前加入 PI(5 mg/mL)至终浓度 50 μg/mL,避光孵育 15 min;孵育完后,过 300 目细胞筛,上机检测;
        • 分析数据。

        注意事项

        • PI 为致癌物质,避免用手直接接触。
        • 细胞数目应该达到 2x104个,细胞数目过少影响实验结果的准确性。
        • 铺板的细胞数量以收获细胞时有足够的生长空间来动态调节,现在的流式细胞仪灵敏度很高,不需要太多的细胞。
        • 在制备时,要特别注意清洗过程中细胞的损失。离心次数不宜过多,防止细胞丢失。
        • 可以用未处理的细胞调试流式细胞仪。
        • 胰酶不加 EDTA。

        常见问题

        Q: 酒精固定后细胞难以沉淀下来,导致细胞丢失较多;

        A: 可适当延长离心时间和转速。

        来源:丁香实验

        ad image
        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序