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        荧光金逆行性标记(上丘及外侧膝状体)

        相关实验:视神经损伤模型实验

        最新修订时间:

        原理

        在上丘和外侧膝状体进行荧光金逆行性标记存活的节细胞。这种方法常结合视神经夹伤模型使用。上丘逆行性标记可分为两种,损伤前标记及损伤后标记。损伤前标记用于研究存活的节细胞,一般在损伤前3d进行标记。损伤后标记一般用于研究存活的纤维及再生纤维,一般在处死前3d进行标记。

        材料与仪器

        步骤

        (1)戊巴比妥钠(50mg/kg体重)腹腔内注射深度麻醉动物。

        荧光金逆行性标记(上丘及外侧膝状体)

        (2)用颅内手术专用固定器将大鼠头部固定。


        (3)自颅顶正中线垂直切开头皮,长约3-4cm,使用双氧水擦拭头皮,暴露矢状缝和人字缝。


        (4)找到Bregma点,确定双侧上丘(以Bregma点为零点,后移6.8mm,旁开1.6mm)和外侧膝状体(以Bregma点为零点,后移4.6mm和旁开3.8mm)在颅骨表面投影,造成4个直径约1mm的骨孔,上丘深4mm,外侧膝状体深5.6mm。


        (5)用牙钻钻开骨孔。


        (6)剪开脑膜,用负压吸引器吸取大脑皮层,暴露双侧上丘和顶盖前区及外侧膝状体。


        (7)使用微玻管戳穿脑膜。


        (8)将一小块浸有5%荧光金的明胶海绵放置于脑表面。


        (9)依次缝合各层组织,做抗感染处理。


        5视网膜铺片及节细胞计数


        (1)千术后相应时间点用戊巴比妥钠过量麻醉处死动物。


        (2)在眼球上做好方向的标记。


        (3)立即取出眼球浸入4%多聚甲醛溶液中,沿角巩膜缘剪除角膜,去除晶状体和玻璃体。


        (4)利用标记的方向分离视网膜并做4个切口,将视网膜分成相等的颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限。


        (5)在4%多聚甲醛中固定40min后,用PBS(0.1mol/L,pH7.4)漂洗3次,每次5min。


        (6)用小毛笔刷将视网膜平铺于载玻片,以50%甘油PBS封片(荧光金在紫外线激发下容易淬灭,加入抗荧光衰减封片剂封片更好)。


        (7)在OlympusBX5l荧光显微镜下,以物镜20倍的栅格框(0.5cmx0.5mm)界定样本区。


        (8)沿每一象限中线,距视盘边缘1、2、3mm各处各选一个样本区,在紫外激发模式下,计数每一样本区内荧光金标记存活的节细胞(图4-11)。

        来源:丁香实验

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