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        膜联蛋白 V 染色法

        相关实验:细胞膜完整性及膜转运功能检测实验

        最新修订时间:

        原理

        细胞凋亡时,其细胞膜上的磷脂分布发生改变,尤其是凋亡早期,细胞膜上的磷脂酰胆碱暴露出来,由于 PS(磷脂酰丝氨酸)外膜化比凋亡引起的核酸变化更早期,成为细胞凋亡的早期指征之一。抗凝剂膜联蛋白 V 具有与带负电荷的磷脂酰胆碱结合的特性,因此可采用荧光素标记的膜联蛋白 V 和 PI 同时染色来检测早期凋亡细胞。也可采用 IHC 方法迸行鉴别。

        材料与仪器

        步骤

        1. 主要试剂的配制


        染色缓冲液:10 mmol/L HEPES-NaOH,pH7.4;140 mmol/L NaCl;2.5 mmol/LCaCl2。


        FITC-膜联蛋白 V 染色液:结合有FITC-膜联蛋白 V 按 1.0 mg/ml 溶于染色缓冲液中(新鲜配制)。


        PI(Sigma,MO,USA)保存液: 1 mg/ml的水溶液,于 4℃ 避光保存。


        2. 操作流程


        2.1 (0.1~1)×106 细胞离心(3000 r/min)去上清后,重新悬浮于 1 ml 的膜联蛋白 V-FITC 染色液中,室温下染色 5 min。


        2.2 在细胞悬液中加入 10 μl 的 PI保存液,室温下染色5 min 后上机检测。


        2.3 流式细胞仪检测采用蓝色激发光(波长为 488 nm 的氩离子激光),绿色荧光检测范围为(530 士 20)nm,红色荧光检测范围为〉600 nm。


        3. 结果观察

        正常活细胞不被着色,仅具有背景染色;早期凋亡细胞膜与膜联蛋白 V-FITC 结合而显示出绿色荧光,但不被 PI 着色,所以无红色荧光;晚期凋亡细胞或坏死细胞则同时显示出强的绿色和红色荧光。


        来源:丁香实验

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