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        ​NAD(H)的测定

        相关实验:由酶循环确定烟酰胺核苷酸实验

        最新修订时间:

        原理

        谷氨酸脱氢酶生成的 NAD 在 LDH 催化下转化为 NADH,在第二步反应中形成的丙酮酸的测定可以通过 LDH 反应中添加 NADH。


        ​NAD(H)的测定

        过量的 NADH 通过碱处理破坏。

        材料与仪器

        步骤

        实验所需「试剂」具体见「其他」


        0.1 ml 循环混合物


        被测定的 x ul NAD 或 NADPH 溶液[x 为 1~20; 浓度为(3~50)×10-9 mol/L]。


        (20~x)ul 0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.0


        37℃ 培养 30 min


        将样品转移到 100℃、2 min 来终止反应,接着将样品转移至冰浴


        每个样品中加入 0.1 ml 溶液 II,25℃ 孵育 15 min,接着将样品转移至冰浴,加入 25 ul 5 mol/L HCl


        0.1 ml 的样品液中加入 0.2 ml 9 mol/L NaOH


        60℃ 孵育 10 min, 然后加入 1 ml 水,测定荧光强度。

        常见问题

        试剂:


        0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.4


        0.1 mol/L α-酮戊二酸(二钠盐,Mr=190.1;190 mg 溶于 10 ml 水中)


        1 mol/L 乳酸盐(钠盐,Mr=112.1;1.1 g 溶于 10 ml水中)


        0.01 mol/L ADP(二钠盐,Mr=471.2;47.1 mg 溶于 10 ml水中)


        1.0 mol/L 乙酸铵(Mr=77.1;771 mg 溶于10 ml 水中)


        谷氨酸脱氢酶(来自于牛肝脏,40 U/mg,配制溶液:40 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.0)


        D-乳酸脱氢酶(来自于猪心脏,约 550 U/mg,10 mg/ml, 配制溶液:55 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.0)


        9 mol/L NaOH(36 g 溶于 100 ml水中)


        0.01 mol/L NADH(71 mg 溶于 10 ml水中)


        磷酸钠缓冲液

        8.97 g NaH2PO4(单水,Mr=138)

        2.61 g K2HPO4(Mr=174.2)

        溶于100 ml水中


        溶液Ⅰ(循环混合物)
        ​NAD(H)的测定

        溶液Ⅱ

        加入新鲜配置的 1 ml 磷酸钠缓冲液中;

        20 ul 10 mmol/L NADH

        储藏溶液 LDH 1.5 ug(稀释储藏溶液 100 倍,取 15 ul)

        来源:丁香实验

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