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        改进 CSA法

        相关实验:亲和免疫组织化学实验

        最新修订时间:

        原理

        已有的研究结果证实,CSA 法较 LSAB 法敏感 500~1000 倍,较 EnVision 法敏感 20~100 倍。其对细胞周期素等核内抗原的定位,有独特的优点,定位准确性、敏感性、稳定性要较标准的 CSA 法好,其敏感性和穿透性要好于 EnVision 法。最近,Hasui K 等(2005)的研究结果表明,CSA 法具有很高的敏感性的同时,也存在严重的内源性物质干扰(内源性生物素、内源性过氧化物酶、第一抗体与组织细胞内的不明物质的非特异性结合),尤其是经抗原热修复后情况更为严重。作者应用标准的 EnVision 法、CSA 法和改进(加阻断剂)的 CSA 法检测淋巴结、正常肝、肝细胞癌、胃肠道鳞癌及癌周正常组织中 ki-67 抗原即为如此。

        材料与仪器

        步骤

        1. 4 μm 石蜡切片常规脱蜡至水,PBS 洗 3×3 min。


        2. 首先用 0.3% 过氧化氢甲醇破坏内源性过氧化物酶的活性,室温 20 min。


        3. PBS 洗 3×3 min。


        4. 抗原修复,室温冷却 20 min。


        5. PBS 洗 3×3 min。


        6. 第二次用 0~3% 过氧化氢 PBS 破坏内源性过氧化物酶的活性,室温 5 min。


        7. 用温的(35℃)TBST [0.02 mol/L(pH 7.8)Tris-HCl+NaCl+0.1% Tween 20] 洗 3×3 min。


        8. 滴加蛋白阻断剂(0.25% 酪蛋白),以阻断第一抗体的非特异性结合位点,10 min,不洗。


        9. 滴加适当稀释的第一抗体(在 S-P 法基础上 5~10 倍稀释),37℃ 孵育 15~60 min,或 4℃ 过夜。


        10. PBS 洗 3×3 min,温的(35℃)TBST 洗 3×3 min。


        11. 滴加蛋白阻断剂(0.25% 酪蛋白),以阻断多聚物试剂的非特异性结合位点,10 min,不洗。


        12. 多聚物(EnVision)孵育 15 min,温热(35℃)TBST 洗 3×3 min。


        13. 滴加蛋白阻断剂(0.25% 酪蛋白),以阻断 CSA 试剂的非特异性结合位点,10 min,不洗;如用荧光素标记酪胺需用 TBST 洗 3 次。


        14. 用生物素标记酪胺孵育 15 min;如用荧光素标记酪胺孵育 15~30 min。温热(35℃)TBST 洗 3×3 min。


        15. 链霉亲和素-HRP 37℃ 孵育 15 min 或 HRP 标记的抗 FITC 抗体孵育 30 min,温的(35℃)TBST 洗 3×3 min。


        16. 0.04% DAB(含 0.03% H2O2)显色 5~10 min。


        17. 复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。

        来源:丁香实验

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