基本方案

进行Southern杂交分析时应标记不带载体的插入片段作为探针,常用的标记方法耗时很长,它包括将质粒或λDNA经限制性内切酶酶解后分离插入片段,用切口平移法或随机引物标记法进行标记。相比之下,采用PCR聚合酶链式反应法标记探针有几个优点,只需极少量的质粒DNA(50ng)作模板即可扩增出大量高效标记的插入片段。在PCR反应中加入非放射性的替换核苷酸(生物素dUTP,地高辛-11-dUTP碱不稳定型),可在数小时内合成大量标记好的探针

1.在一加有1mL LB-抗生素培养基的5mL溶血管中接种一单菌落,松松地盖上管帽,37℃剧烈振荡培养过夜。

2.取800μL菌液至一1.5mLEppendorf管中。台式离心机12000r/min离心30s。余下的菌液于4℃保存或加入40μL灭菌甘油混匀于-80℃保存。

3.弃上清液。用400μL 1%TritonX-100剧烈振荡重悬菌体沉淀。

4.菌体悬浮液煮沸5min后于冰上放置5min。细菌裂解液置于4℃或-20℃保存。

5.取一微量扩增反应管,加入以下试剂至终体积50μL:

25μL灭菌蒸馏水

10μL50%灭菌甘油

5μL 10×PCR反应缓冲液

0.5μL 5mmoL/LdATP

0.5μL 5mmoL/LdCTP

0.5μL 5mmoL/LdGTP

1μL 2mmoL/LdTTP

1μL 0.2mmoL/L地高辛-11-dUTP碱不稳定型

0.625μL 20μmoL/L引物1

0.625μL 20μmoL/L引物2

0.25μL 5U/μLTaq聚合酶

5μL细菌裂解液

6.按以下参数进行PCR扩增

1个循环:94℃,1min

35个循环:94℃,15s

48℃,30s

72℃,3min

1个循环:72℃,7min

7.取3μLPCR扩增产物进行水平琼脂糖凝胶电泳,用已知浓度的标准DNA作对照估算扩增产物的浓度。余下的PCR扩增产物置于4℃保存。

采用非同位素法检测的优点主要有:

(1)降低了实验操作者的危险,实验废物无需专门处理,从而可以处理大批RFLP分析的样品。

(2)可标记多个、大量探针以备日后之需。标记好的探针可置于-20℃保存(至少一年)。

(3)在进行RFLP分析时,化学荧光检测系统的探针、CSPDR和膜均可重复使用(分别为3～5次、3～5次、5～8次或更多)。与同位素检测方法相比更为经济。

(4)实验安排更为方便。因为无需像使用32P时那样要受同位素的衰减时间限制。

(5)室温下曝光即可,无需使用增感屏或-80℃冰箱。

(6)曝光时间短(几小时),也就是说一张膜每3d即可重新杂交一次

试剂说明：

1.LB培养基(1%胰蛋白酶,1%NaCL,0.5%酵母抽提物,pH7.0),抗生素,1%TritonX-100,灭菌超纯水,50%灭菌甘油,10×PCR反应缓冲液(0.1moL/LTris-HCL,pH8.3;15mmoL/LMgCL2;0.5moL/LKCL;1mg/mL明胶);

2.psr142引物:

20μmoL/L反向引物:5 ATTCGAGCTCGGTACC 3

20μmoL/L正向引物:5 AGGTCGACTCTAGAGG 3

3.FBA065引物:

20μmoL/L反向引物:5 AACAGCTATGACCATG 3

20μmoL/L正向引物:5 GTAAAACGACGGCCAGT 3

4.5mmoL/LdATP、dGTP、dCTP溶液,2mmoL/LdTTP溶液,0.2mmoL/L地高辛-11-dUTP(碱不稳定型),5U/μLTaq聚合酶。