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        悬浮细胞培养

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 将含有冻存 HeLa S3 细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。


        2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒,打开安瓿,用吸管将细胞转移到含有 5 ml 完全 MEM-10 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中,轻轻摇动培养瓶,使细胞均匀分布于培养瓶中,放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。


        3. 将培养基吸出,用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆盖细胞,消化 30~40 s。


        4. 加入 10 ml 旋转瓶完全培养基-5,并将细胞转移至 50 ml 的离心管中。室温 1800 g 离心 5 min,弃上清。


        5. 将细胞沉淀悬浮在 5 ml 的旋转瓶完全培养基-5 中,上下吹打,将细胞团打散。


        6. 在 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶中加入 50 ml 旋转瓶完全培养基-5,并将细胞悬液转移到瓶中。


        7. 取出 1 ml 细胞悬液,用血细胞计数器(附录 3F) 进行细胞计数。加入适量的旋转瓶完全培养基-5,使细胞密度为(3~4)× 105 细胞/ml。将细胞放入无 CO2 培养箱,37℃ 旋转培养。


        8. 随后的两天让细胞继续生长,并且每天对细胞进行计数,加入适量的旋转瓶完全培养基-5 以维持(3~4)×105 细胞/ml 的细胞密度。


        9. 取 1 ml 的细胞悬液,用血细胞计数器对细胞进行监测。


        10. 当细胞密度达到(4~5)×105 细胞/ml 时,隔天或每天用培养基将细胞稀释至 1.5×105 或 2.5×105 细胞/ml。


        11. 分别将装有 50 ml 或 100 ml 细胞悬液的 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶放入 37℃ 无 CO2 培养箱旋转培养。每天或隔天传代。



        注意事项

        由于有些细胞是不能被养活的,所以需要高的初始密度。

        常见问题

        HeLa S3 细胞用旋转瓶完全培养基-5 在通气旋转瓶中于 37℃ 无 CO2 培养箱生长和维持。细胞用新鲜的旋转瓶完全培养基-5 每天或隔天进行稀释,以保持细胞的密度为(1.5~5)×105 细胞/ml。

        来源:丁香实验

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