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        基本方案

        相关实验:蛋白质的毛细管电泳分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        仪器、耗材

        步骤

        「操作条件选择」具体见「其他」


        1. 毛细管电泳柱的制备:清洗、反应与柱平衡;


        2. 移开进样端的缓冲溶液池,换上样品管;


        3. 使用低压或电迁移方式进样;


        4. 再换上缓冲溶液池;


        5. 施加分离所需的电压。 进行电泳分析。

        常见问题

        操作条件选择


        1. 毛细管尺寸


        最常用的为内径为 25~75 um 熔融石英毛细管,从分析时间上考虑,毛细管应尽可能得短,常用的有效长度(进样端至检测窗之间的距离)为 20~50 cm。


        2. 高压电源


        HPCE 所用的高压电源要能提供 30 kV 的直流电压和 200~300 uA 的电流。欲获得迁移时间的高重现性,须使电压稳定在 ±0.1%。电源极性应能切换。恒压方式最为常用,当进行等速电泳或温度不能很好控制时,则应采用恒流或恒功率方式,从而获得恒定的迁移时间。


        3. 温度控制


        由于进样和迁移时间决定于溶液的黏度,应将温度控制在 ±0.1℃,这对于操作的重现性是很重要的。采用液体恒温较气体恒温更为有效。


        4. 进样量


        样品区带长度应该小于毛细管长度的 1%~2%。样品超载会使峰变宽,峰形畸变。


        5. 进样方式


        采用流体力学的方式,进样量基本不受样品基质的影响;电迁移进样时,进样量决定于每一个组分的电泳淌度,应注意歧视效应带来的影响。


        6. 样品预浓缩


        在等速电泳和等电聚焦分析中,样品在稳态时可被浓缩许多倍,有利于紫外检测分析,但在毛细管区带电泳中,样品区带会展宽,因此常需要采用样品堆积、等速电泳和色谱法,通过对低电导介质的电动进样或压力进样来达到样品堆积的目的。非连续的缓冲系统被用于柱上低浓度样品的浓缩,进样体积较常规方法要大 30 倍。采用整个毛细管进样技术,样品可以浓缩 400~1000 倍。


        瞬态等速电泳浓缩既可采用典塑的等速电泳电解质系统,也可以在样品中补充高淌度的与分离的样品电荷符号相同的离子(co-ion), 而电解质的同号离子具有低淌度。在电泳过程中,由等速电泳模式逐渐转变为区带电泳模式。


        色谱法预浓缩是先将样品捕集于一反相或亲和填料,然后用少量溶剂洗脱下来,同时使样品得到净化,如蛋白 G 和结合亚胺二乙酸金属螯合功能团的固定相。采用很低浓度的缓冲液和孔径非常小的聚丙烯酰胺凝胶进行浓缩,样品中的水扩散入凝胶,盐分同时被脱除,可适用于少量样品的处理。

        来源:丁香实验

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