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        不连续非变性凝肢电泳

        相关实验:不连续非变性凝肢电泳实验

        最新修订时间:

        原理

        非变性凝胶电泳通常是在高 pH(8.8)缓冲液条件下进行。这时,多数蛋白质带负电荷,并向阳极迁移。

        材料与仪器

        步骤

        1. 工作溶液配制


        不连续非变性凝肢电泳不连续非变性凝肢电泳


        2. 工作溶液用量

        (1)制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积

        制备两块 6 cm×8 cm 的凝胶

        不连续非变性凝肢电泳

        配制量应比实际用量稍多些。


        (2)X% 分离胶的计算

        不连续非变性凝肢电泳


        3. 制备分离胶


        (1) 按操作指南装配好灌胶用的模具;

        不连续非变性凝肢电泳


        (2) 将 A 液、B 液和水在小的三角瓶或试管中混合(由于丙烯酰胺具有神经毒性。 应戴手套操作);


        (3) 在温和搅拌下,加入过硫酸铵,TEME 混匀。由于这一步中发生聚合,动作要迅速;


        (4) 将上述胶液用滴管移入凝胶模具;


        (5) 加完分离胶后,立即轻轻在其顶部覆盖 1~5 mm 的水垣;


        (6) 静置 30~60 min,待凝胶聚合;当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将出现一个明显的界面,这时将凝胶稍微倾斜。 判断凝胶是否聚合。


        4. 堆积胶的制备


        (1) 除去覆盖在分离胶上的水层;


        (2) 在小三角烧瓶或试管中,将 A 液,C 液和蒸馏水混合;


        (3) 在温和搅拌下,加入过硫酸铵和 TEMED,混合均匀;


        (4) 吸取堆积胶溶液加到分离胶之上,直至溶液到达前玻璃板的顶部。


        (5) 将梳子小心的插入到两块板之间,直至梳子齿底部到达前玻璃板的顶部,在梳子齿端避免留下气泡。


        (6) 放置 30 min,堆积胶可聚合;


        (7) 待堆积胶聚合后,小心的取出梳子,不要使加样孔裂缝;


        (8) 将凝胶置入电泳槽中,并接好正负电极;


        (9) 将电泳缓冲液加入内外电泳槽中。 确保凝胶的上部和底部都浸在缓冲液中。


        5. 样品制备


        (1)加样孔的样品容量(Mini-Gel 系统)


        (2) 将蛋白质样品和样品缓冲液(20 ul + 5 ul)在 Eppendorf 管中混匀;


        (3) 用微量注射器将样品加入加样孔中;


        (4) 在加入不同的样品之前。用注射器抽吸少量的电泳缓冲液冲洗注射器,以避免样品间的相互污染。


        6. 电泳


        (1) 将电极插头与适当的电极相接,对于体育 pH 8.8 的凝胶,电流应流向阳极;


        (2) 将电压调至 100~200 V;


        (3) 电泳值示踪染料的前沿迁移到距凝胶底部约 1~5 mm处;


        (4) 关闭电源;


        (5) 拔掉电极插头;


        (6) 取出电泳凝胶板,放在一个安全的地方,轻轻撬开凝胶两边的玻璃板,使胶粘在其中的一块板上。


        7. 凝胶染色


        (1) 戴手套,将凝胶转移到一个含有约20 ml考马斯亮蓝的培养皿内;


        (2) 在摇床上缓慢震荡,0.75 mm 的胶需要 5~lO min。1.5 mm 的凝胶需要 10~20 min,;


        (3) 去除染液;


        (4) 加入约 50 ml 脱色液,继续轻微震荡;


        (5) 为了脱色完全,需数次更换脱色液并震荡过夜;可进行干胶保存。

        来源:丁香实验

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