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        人骨髓不连续密度梯度离心用于MSCs生产

        相关实验:骨髓基质来源的间充质干/祖细胞(MSCs)的培养基本原则和鉴定

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        (a)去除抗凝管盖子,将骨髓液转移至50mL离心管中。加人室温的HBSS,确保体积达到25 mL。


        (b)取另一个50 mL离心管,加人20 mL Ficoll-Paque淋巴细胞分离液,将25 mL细胞悬液轻轻加到Ficoll上层。HBSS与Ficoll间的界面不能被破坏。


        (c)关闭闸,室温1800g离心30min。


        (d)离心完毕,于Ficoll和HBSS的界面收集白色细胞层,将其移至新的50 mL离心管中。


        (e)用HBSS将收集到的细胞悬液体积调至3倍,室温1000g离心10 min。重复洗涤。


        (f)用30 mL预热至37℃的CCM重悬细胞


        (g)取10μL细胞悬液加入到10μL台盼蓝中,血细胞计数器评价细胞的存活率,存活率需高于80%。


        (h)将30mL细胞悬液移至直径15 cm组织培养皿中,于5% C02培养箱中培养至少15h。


        (i)从培养箱中取出培养皿,吸出培养基。


        (j)加入20 mL预热的PBSA,润洗单层细胞,弃去。


        (k)重复润洗过程3次。


        (l)加人30 mL预热的新鲜CCM。


        (m)每隔一天重复此润洗和更换培养基操作,共6天。


        (n)6天后,在倒置显微镜下观察单层细胞,贴壁的、成纤维细胞样MSCs克隆在培养皿中清晰可见。有时可能有造血细胞污染的迹象,但这些细胞可以在传代时被去除。培养物达到50%〜60%汇合时,进行扩增和冻存处理。

        常见问题

        培养基配方:

        完全培养基(CCM):α-MEM: α低限量基础培养基 含谷氨酰胺 无核苛酸或脱氧核苷酸;添加:附加L-谷氨酰胺2 mmol/L(终浓度 包含组分内的谷氨酰胺共4 mmol/L),20%经FBS杂交瘤纯化 非热灭活,青霉素100 U/mL,链霉素100μg/mL。过滤除菌 储存于4℃ 不超过2周。

        来源:丁香实验

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