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        小鼠胚、鸡胚或者器官中RNA杂交的酶学检测

        相关实验:RNA 在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1) 从杂交过的小鼠胚或鸡胚或器官样本移除杂交溶液并加入800μL预杂交溶液A, 7℃洗 5 min。


        2) 不要移除预杂交溶液,向试管中再加入400μL 2×SSC, pH 4.5溶液,70℃洗 5 min,重复加2×SSC2次,并再洗2次。


        3) 移去混合液,并在0.1% CHAPS/2×SSC中70℃洗两次,每次洗30 min。


        4) 用含有20μg/ml RNA 酶 A 的 0.1% (V/V) CHAPS/2×SSC 溶液 37℃消化1 h。


        5) 先用MAB室温下洗样本两次,每次10 min,再在70℃用MAB洗2次,每次 30 min。


        6) PBS室温下洗样本两次,每次10 min。


        7) PBT室温下洗5 min。


        8) 室温下用封闭液封闭样本2〜3 h。


        9) 移去封闭液,加入2 ml预吸附处理的连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体Fab片段。4℃下轻摇过夜。


        10) 移除溶液并加入0.1%(m/V) BSA/PBT溶液,将样本转移到20 ml的带咬合盖玻璃 小瓶中,用0.1% (m/V) BSA/PBT溶液室温下洗5次,每次45 min并轻轻摇晃。


        11) 用PBT溶液洗2次,每次30 min。


        12) NTMT缓冲液洗3次,每次10 min。


        如果使用Boehringer Mannheim公司的BM紫AP底物溶液则只需洗2次。


        13) 将样本完全浸没于3 ml NBT/BCIP显色溶液或者BM紫AP底物溶液中孵育。用锡 箔包住小瓶轻轻摇晃20 min开始显色。


        14) 用肉眼或者用解剖镜观察染色情况。当信号达到希望的水平时(20 min〜48 h), 用PBT至少洗6次以停止显色反应。


        显色的样本能够在4℃下含有100 mmol/L EDTA的PBT中保存2〜3个月而不影响信号强度。


        15) 可选:在4%PFA/PBT中4℃固定样本过夜。用PBT洗样本数次然后在PBT中 4℃存储。


        16) 样本放在PBT溶液中在皮氏培养皿拍照。

        常见问题

        其他试剂:


        20μg/ml RNase A (Boehringer Mannheim)溶于 0.1% CHAPS/2×SSC, 70℃。

        马来酸缓冲液(MAB) 70℃和室温 ,PBS,PBT :0.1% Tween-20/PBS,封闭液

        连接碱性碟酸酶的抗地高辛抗体的Fab片段(Boehringer Mannheim),预吸附的 40℃,0.1% (m/V) BSA/PBT,碱性磷酸酶缓冲液 pH 9.5 (NTMT),新鲜配制

        2 mmol/L左旋咪唑/NTMT (可选的),NBT/BCIP 底物溶液或者 BM 紫 AP 底物

        来源:丁香实验

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