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        基本方案

        相关实验:用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析 DNA-蛋白质相互作用

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1) 用合适的限制性内切核酸酶切割0.5μg含有结合位点的质粒DNA (假设一个5 kb 的质粒),产生一个长为150〜700 bp的片段,这个片段的大小和内切酶切出的其他片段的大小不同。用酚抽提及乙醇沉淀纯化。


        2) 建立以下15μL的结合反应:


        5μL H2O


        3μL5×结合缓冲液


        5μL DNA (DNA 片段各 9 nmol/L)


        1μL 10 mg/mL poly (dl-dC) . poly (dl-dC)


        1μL35S标记的蛋白


        室温下温育20 min。


        设立不含有DNA及含有非特异性DNA (即缺乏结合位点)的对照反应。


        3) 加5μL加样缓冲液,立刻加样到5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上。进行电泳,直至溴酚蓝接近胶的底部(根据缓冲液条件,大约需要1〜4 h),不要让胶的温度高于室温。 胶的组成及缓冲液的离子强度可作改变,并且这些改变对于检测蛋白质-DNA的相互作用可能很重要。


        4) 电泳结束后,将凝胶置于45%甲醇/10%乙酸中室温下固定1 h。用EN3HANCE处理胶1 h,干胶,然后进行放射自显影。

        常见问题

        与更为常用的迁移率变动分析法中采用32P 标记的DNA及不标记的蛋白质有所不同,这里介绍的分析方法一般用的是35S标记的蛋白质与不标记的DNA。这个方法的主要优点是:任何突变蛋白质只要改变DNA模板就可以测定其DNA结合性质,并且可以检测其亚单位结构(如二聚体、四聚体)

        来源:丁香实验

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