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        基本方案2 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白质

        相关实验:酶法检测磷酸化实验

        最新修订时间:

        原理

        蛋白质磷酸酶和上面讨论的普通磷酸酶不同,它可在磷酸蛋白质底物的不同位点选择性脱磷酸化,因而可用于研究与蛋白质键合的特定磷酸基的功能性作用。

        材料与仪器

        步骤

        1. 100 μg 总蛋白溶于 100 μl Tris/DTT/MnCl2 缓冲液 pH 7.5,对照反应加 1 μl Microcystin-LR。37℃ 温育 10 min。


        Microcystin-LR 是 PP1 和 PP2A 的有效抑制剂。


        2. 加入 0. 2~0. 5 U PP2A,37℃ 温育 10~30 min。


        1 U PP2A 或 PP1 在 30℃,pH 7.5,1 min 可水解 1 nmol 磷酸化酶 A。


        3. 加入 Microcystin-LR 至终浓度 1 μmol/L 终止脱磷酸反应。


        4. 用 SDS-PAGE 分析脱磷酸物或进行功能测定(见基本方案 1)。



        来源:丁香实验

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