由 h E S 细 胞 产 生 胚 胎 样 小 体

方 案 2. 14 由 h E S 细 胞 产 生 胚 胎 样 小 体

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 生 长 于 M E F s 之上的未分化的 h E S 细胞集落

□ 加样器，设置在 50ul

□ 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿（特 殊 包 被 过 的 皿 ，可 防 止 细 胞 附 着 ；见 2.9节） ， 2. 6 cm。

□拉长的玻璃吸管（见方案 2.7)

非无菌

□ 带 有 37°C 加热台的解剖显微镜

步骤

(a) 在 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿 中 加 人 2〜3 ml h E S 培 养 基 。

(b) 从温箱中取出未分化的 h E S 细胞，放在解剖显微镜的加热的台子上。

(C) 用拉长的玻璃吸管（见方案 2. 7) 将集落切成小块，块的大小大约与hES细胞手工传代切的大小（300〜500 个细胞）相同，要小心解剖，只取未分化的细胞。

(d) 当集落的所有合适的区域都被分离，得到足够的细胞小块时，收集所有漂浮的小块转移至低附着力的培养皿中，细胞团块而后将形成自由漂浮的细胞球体—- 胚胎小体（Ebs) (图 2. 4)。

(e) 第二天早上检查一下这些 Ebs, 确认它们没有贴附在皿底，如果贴附了，可以用拉长的玻璃吸管小心地使它们移动，可以自由漂浮。

(f) 在 标 准 h E S 培养基中孵育这些 Ebs 3〜5 天，每天补充 lm l 培养基