• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立

        相关实验:人胚胎干细胞系:衍生与培养实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        方 案 2. 6 人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立

        试剂与材料

        无菌或无菌制备

        □ 5〜6 天的人胚泡,经 H F E A 允许,并且像先前讨论的完全经病人同意。 HFEA所要求的全部细节能够在 H E F A 的网站找到(http//:www.hfea.g0v.uk)。

        □链霉蛋白酶, 0 . 5 % ,溶 于 DMEM

        □ 抗 人 抗 体 , 3 0 % 〜5 0 %

        □含有 Glutamax 的 DMEM

        □ h E S 培 养 基(见 2. 2. 1 节)

        □豚鼠的补体,用 DMEM I : 1 稀释

        □ 4 孔培养板的每个孔以 7.5X 104 的细胞数接种新的失活的 M EFs,含 有 500ulHES 培养基

        □大孔吸管

        步骤

        (a) 使胚胎生长到胚泡阶段,通常大约 5 天。

        (b) 如果胚胎没有从透明圈里孵出,用 5〜IOuI 的 0 . 5 % 链霉蛋白酶在 37°C 孵育直到透明圈溶解。

        (c) 将无透明圈的胚泡与抗人抗体孵育 i 〇 min,此抗体用含Glutamax 的 DMEM稀 释 3 0 % 〜5 0 % 。

        (d) 在孵育之后,用 h E S 培养基短暂地冲洗胚泡使抗人抗体失活。

        (e) 用 5〜IOmI 2 0 % 的豚鼠补体与胚泡在 37T:孵 育 5〜15 min, 目的是溶解胚胎滋养层,此时用大孔吸管轻轻吹吸胚胎将有助于溶解过程。

        (f) 当胚胎滋养层完全溶解,用吸管轻轻地取出完整的内层细胞团并立即转移到含有 500ul h E S 培养基的 M E F s 培养板上。

        (g) IC M 细 胞 2〜5 天内将贴壁,要每天观察细胞的生长。要在原位 停 留 1 5 天以上 ,如果需要,可以添加新的灭 活 的 MEFs (只有当集落大到足以传代时才能将它转到新 的 M E F s 培养板上)。

        (h) 从 ICM 来源的细胞具有类干细胞的形态,通常出现在集落的中心。

        (i) 当克隆达到约 0_1〜0.5 mm 大小时,用拉长的玻璃吸管将它们切割成 2〜10小块并转移到 2〜4 孔新的失活的 M E F s 培 养 板 中(见 方 案 2.7)。这个过程每 5〜7 天重复一次。

        (j) 在新建立的 h E S 细胞系前几次传代之后, h E S 细胞的增殖就可按以下方案进行(见 2.5 节)。

        注意: 一旦超过单一集落,初 建 的 h E S 细胞系的团块每一代都要冻存直到获得了大量冻存成功的冻存管(见 2 . 6 节)。 前 10〜1 5 代 最 少 5 0 % 的细胞将被冻存直到细胞系被很好的建立。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序