整合膜蛋白在单室脂质体中的无细胞翻译实验

基因克隆

这一方法需要两步 PCR (Blommel et al.,2006;Thao et al.,2004)。图 37.2 提供了pEU-HSCB 的载体图谱和用于克隆 His6-细菌视紫红质的引物设计例子 (Blommel andFox，2007)。使用这一载体和引物设计方案，T E V 蛋白酶能够切MGHHHHHHAIAENLYFQ 序列，从而丝氨酸成为成熟蛋白质的第一个氨基酸。烟草花叶病毒 omega序列为翻译增强子序列 (Sawasaki et al.,2000)。将 Sg/ I 和 PmeI 酶切位点加人相应引物中标明的位置，便可用 Flexi Vector cloning 方法 (Blommel et al.,2006) 将克隆的基因转移到表 37• 1 中提到的任一（或所有）载体以及许多其他商品化的载体（见 http ://www.promega.com for other examples) 中。当相应的转化物在含有 5 % 蔗糖的平板上生长时，图 37. 2 中显示的 s a c & C A T 盒能够提供毒性筛选。这种方式能够更有效的筛选包含目的基因的阳性克隆，同时 sac& C A T 也提供了针对氯霉素的抗性。 p F I K 同源区增强了在不同 Flexi 载体间转移克隆基因的效率 (Blommel et al.,2006)。

图 37. 2 B 给出的例子中，第一步 P C R 使用的 5’正向引物含有基因特异的核苷酸序列 ，并 在 5’末段加入了一段能够编码部分 T E V 酶切位点的不变序列。图 37. 2 C 中显示的 3’反向互补引物包含了基因特异的核苷酸和 PmeI 位点。可以通过在设计引物时替换特异基因序列以克隆其他基因。

第二步 PCR 使用了通用的正向引物（图 .37. 2B)，其中含有能补全 T E V 酶切位点的序列和 Sg/I 位点。通用的反向 PCR 引物用于复制 PmeI 位点并加人附加的核苷酸（图37.2 B) 。在第二步 P C R 中，将第一步 P C R 的部分产物加人含有通用正向引物和反向引物的新 P C R 反应体系中, 从而获得可正确用于 Flexi Vector cloning 的 P C R 产物。

PCR 产物纯化

P C R 产 物 在 S g / I/P m e I 酶切前需纯化。

材 料 和 试 剂

PCR 纯化试剂盒 [Quickstep 2 PCR purification kit (EdgeBio，Gaithersburg，MD)]，含有SOPE 树脂、安全的无菌密封带、performa Ultra 96 孔平板和 V-Bottom 9 6 孔板。

实验方案

⑴ 加 4 uL 充分混悬的 S O P E 树 脂 到 20 jlxL P C R 产物 (来自上述 F L E X I - T E V P C R实验方案)。

(2) 用安全的无菌密封 带 密 封 板 子 并 涡 旋 。悬 液 室 温 静 置 。同时准备;performaUltra 9 6 孔平板。

(3) 去 除 Performa Ultra 9 6 孔平板顶部和底部的黏性密封，加上盖子。

⑷ 将 Performa Ultra 96 孔平板叠在一个 9 6 孔平底微量培养板之上。

(5) 将此装置放人有衬塾的离心用平板托架 (plate carrier)。

(6) 850 g 离心 5 min。

(7) 短暂离心使 S O P E /P C R 混合物富集到孔的底部。缓 慢 用 移 液 器 将 S O P E / P C R反应混合物直接转移到 Performs Ultra 96 孔平板。确保液体流进胶基质。 加 上 盖子。

(8) 将 Performa Ultra 96 孔平板叠在 96 孔 V - b o t t o m 微量培养板之上。

(9) 将此装置放人离心机平板托架,850 g 离 心 5 m i n 。保留内含纯化 P C R 产物的洗出液。 P C R 产物在准备使用前可以保存在一 20°C 。

Flexi 载体和 PCR 产物酶切反应

以下步骤是在连接前用 S g / I 和 P m e I 消 化 p E U 载体变体和纯化的 P C R 产物 。使用 FIexi V e c o t r 系统克隆的额外描述参见其他文献（B l o m m e l and F o x ，2007; B l o m m e l
et al.,2006)。成 功 的 Flexi V e c t o r 克隆重要的是避免过度消化 P C R 产 物 和 Flexi 载体。Sgf1 具有星号活性，过度消化会去除黏性末端，使消化后的载体变为平末端，这会导致载体自连并产生无插人片段的高背景克隆。

试剂

5X Flexi 消化缓冲液 (P r o m e g a );10X S g f1/ P m e I 酶混合剂 (P r o m e g a );p E U 载体变体 (表 37. 1); 纯 化 P C R 产物 [自 P C R 产物纯化实验方案第 (9) 步]。

连接反应

酶切和纯化后的 P C R 产 物 及 p E U 变体载体在本步骤中连接。为了获得最高效率的连 接 反 应 ，要 点 是 使 用 高 浓 度 的 连 接 酶 。

试 剂

1 0X T 4 D N A 连 接 酶 缓 冲 液 (Promega); 高 浓 度 的 T 4 D N A 连 接 酶 (Promega);pEU变 体 载 体（自 Flexi 载 体 消 化 反 应 第 (2) 步）；

纯 化 后 的 P C R 酶 切 产 物 [来 自 P C R 产 物 酶 切 反 应 第 (6) 步 ]。

实验方案

(1) 建 立 连 接 Master M i x ，包 含 225 ul 无 菌 去 离 子 水 、I l O uL 10 X T 4 连 接 酶 缓 冲液 和 5 0 ul 高 浓 度 的 T 4 D N A 连 接 酶 。

(2) 向 新 P C R 板 的 每 个 孔 中 加 人 :5.0 ul 纯 化 后 的 P C R 酶 切 产 物 、2.0 ul消 化 的p E U 载 体 和 3. 5 p L 连接 Master M i x 。此 为 连 接 板 (ligation plate) 。

(3) 将 连 接 板 在 热 循 环 仪 中 25°C 孵 育 3 h 。

(4) 立 即 转 化 或 在 4°C 过 夜 保 存 连 接 板 。

转化反应

以下步骤为连接反应产物转化感受态细胞。按照制造商的实验方案，Invitrogen 和P r o m e g a 的感受态细胞均已成功使用。

材 料 和 试 剂

用于转化的10 G化学感受态细胞（LUCig en ,Middleton,W I );10 G 细胞回收液(Lucigen); 连接板 [来自连接反应第（4) 步];F i s h e r b n m d 无菌一次性培养皿（60 m m X15 m m ) (Fisher Scientific,Pittsburgh,P A ); Y T 琼脂平 板 ，含有 0.5% (W /V ) 葡 萄 糖 、50 ug/m L 卡那霉素, 并含有 5% 蔗糖用于筛选 p E U -H S C B 载 体 (图 37. 2) ;ColiR oiler 平板 珠（N o v a g e n ，Gibbstow n ，N J )。

实验方案

(1) 将 10 G 化学感受态细胞从一 80°C 冰箱取出放于冰上融化。

(2) 均 分 1 0 ul 细 胞 到 预 冷 的 P C R 板 或 strip 管中。

(3) 加 人 I.0 连接产物后用移液枪头尖搅勻。

(4) 冰上孵育至少 5 m i n 。将热循环仪设置锁定到 34°C 。

(5) 34°C 热 休 克 30 s(小的反应体积要按制造商的说明）。

(6) 转化反应物放回到冰上，孵 育 2 m i n 。

(7) 从冰上移出，加 入 80 fxL 处于室温的复苏培养基。

(8) 37°C 孵 育 I h 。不要摇动。

(9) 在孵育转化物的同时，标 记 ％ 个含有合适抗生素和 A 1-H 1 2 的 Y T 板底部, 并在每个板中加入 5〜10 个 无 菌 ColiRoller 玻璃珠。

(10) 向每个对应标记的板子中加入全部的转化反应物。圆周运动摇动板子使液体分散 。翻动板子小心将 ColiRoller 珠移出到合适的废液容器中，或者放 人 1 0 0 % 乙醇以备下次使用。

(11) 37°C 过夜孵育板子。

质粒 D N A 的纯化

所有用于体外转录和翻译的试剂必须是无 R N A 酶的。因此，所有用于制备无细胞反应的玻璃器皿一定要在 18 〇 °C 烘 烤 3 h 以 去 除 R N A 酶 。此 外 ，要戴手套，并在处理试剂时避免说话和打喷嚏以防止手上和唾液中的 R N A 酶污染。除非另有说明，所有缓冲液必须用〇.2 um 滤器过滤除菌, 保存在一 20°C 。

另外，除非另有说明，用 18 MΩ的水 (Milli-Q water,Millipore,Billerica,M A ) 制备所有试剂。焦碳酸二乙酯 (D E P C ) 处理的水不能用于本实验方案，因 为 D E P C 的降解产物会抑制体外转录和翻译反应。

试剂

用于蛋白酶K的 10X缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、50mmol/L
EDTA和 l % ( m/ V ) S D S

蛋白 酶 K 购 自 S i g m a/Aldrich(St.Louis，M O )。在 I.0 m L I O X 蛋 白 酶 K 的缓冲液中加入 0.5 m g 蛋 白 酶 K 以制备 I O X 蛋 白 酶 K 溶液。将 此 蛋 白 酶 K 溶液分装为 10ul并保存在一 80°C 。

mRNA 制备

在无细胞翻译中，m R N A 是蛋白质合成反应必要的反应物。为了获得最高的转录效率, 必须加人足够量的 m R N A 以饱和翻译反应中的核糖体。

试剂

含 M g 转录缓冲液 (5X ): 400 m m o l / L H E P E - K O H ( p H 7.8)、100 m m o l / L 乙酸镁 、10 m m o l / L 盐酸精脒（spermidine hydrochloride) 和 5 〇 m m o l/L D T T 。一 20° C 保存。

N T P 溶液： 含 有 25 m m o l /L 的 A T P 、G T P 、C T P 和 U T P , 分 别 由 0.2 u m 滤器无菌过 滤 的 100 m m o l / L N T P (Milli-Q 水溶解) 制备。 N T P 溶液保存在一 8 0° C 。

S P 6 R N A 聚合酶和 R N A 酶抑制剂 (R N a s i n ) 购 自 P r o m e g a 。

脂质体的制备

将单室脂质体加入无细胞翻译反应中以捕获新翻译的膜蛋白。这一步骤提供了与用去污剂增溶膜蛋白不同的另外一种方法。去污剂的存在会导致不能直接测定膜蛋白的功能。

材 料 和 试 剂

大豆完全抽提物（2 〇 % 卵磷脂) 购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster，A L )。

脂 质 再 水 化 缓 冲 液（lipid rehydration buffer): 25 m m o l / L H E P E S ( p H 7. 5)、IOO m m o l / L N a C l 。

0.4 um 和 0. I um 的 径 迹 蚀 刻 聚 碳 酸 醋 膜 (Track-etch polycarbonate m e m b r a n e ) ，购自 Nucleopore(Pleasanton，C A ) 。

用 于 制 备 单 室 脂 质 体 的 迷 你 型 挤 压 机 购 自 Avanti Polar Lipids。

实验方案

(1)将 I g 大 豆 完 全 抽 提 物 (2 〇 % 卵 磷 脂 ) 溶 解 于 3 m L 氯 仿 。

(2) 用 N 2 气 流 冲 洗 脂 质 溶 液 以 去 除 大 部 分 有 机 溶 剂 。真 空 干 燥 剩 余 脂 质 30 m i n 。

⑶ 用 67 m L 的 脂 质 再 水 化 缓 冲 液 重 悬 干 的 脂 质 。涡 旋 脂 质 溶 液 直 到 勻 质 。 3 〜 5个 冻 融 (freeze/t h a w ) 循 环 会 帮 助 脂 质 的 水 化 。

(4) 通 过 迷 你 型 挤 压 机 形 成 单 室 脂 质 体 。先 将 脂 质 体 溶 液 穿 过 0. 4 的 Tracketch 聚 碳 酸 酯 膜 11 次, 再 穿 过 0.I u m 的 Track-etch 聚 碳 酸 酯 膜 11 次 。

(5) 分 装 脂 质 体 并 快 速 冷 冻 。此 方 法 制 备 的 脂 质 体 可 以 在 一 80°C 保 存 。

小麦胚芽翻译反应

图 37. 3 比 较 了 双 层 反 应（bilayer reaction) 和 透 析 反 应（dialysis reaction) 的 建 立 方法 。双 层 反 应 利 用 提 取 物 和 上 层 缓 冲 液 的 密 度 差 异 将 提 取 物 和 m R N A 与 其 他 反 应 物 相互 隔 离 。这 种 情 况 下 ，底 物 和 产 物 的 扩 散 发 生 在 整 个 缓 冲 液 界 面 。 由 于 装 置 简 单 ，双层无细 胞 翻 译 反 应 可 以 自 动 操 作（Sawasaki et al. 2002a;Tyler et al. ,2005;Vinarov et al. ，2004;2006)。 根 据 我 们 的 结 果 ，双 层 反 应 可 以 生 产 约 0.2 m g / m L 的 不 同 膜 蛋 白 。然 而 ，由 于 扩 散 稀 释 了 反 应 ，产 量 受 到 限 制 。

并 能 从 50 uL 扩大到 10mL 或更大体积而不会有容积生产率(volumetric productivity)的总体改变。这一方法可用较小的体积对少数蛋白质进行简单筛选; 而对于已经通过小规模方案了解了性质并发现可以深人研究的蛋白质，也可用较大的体积进行规模化生产。采 用双层和 透 析 反 应 的 自 动 批 次 化 的 无 细 胞 翻 译 的 实 验 方 案 都 已 经 发 表（E n d o andSawasaki,2006; Sawasaki et al.，2002a ;Vinarov et al. ,2006)。对于完整膜蛋白的翻译，我 们 发 现 加 人 单 室 脂 质 体 能 够 有 效 的 改 良 翻 译 反 应（G o r e n and F o x ,2008; N o z a w aet al.,2007)。

(2) 向 ％ 孔 U 形底板的单孔中加入 5 卟 的 m R N A 制备物。

(3) 在每个孔中的 m R N A 样品中再加人 20uL 翻译混合物，混匀。

(4) 小 心 加 入 125 fxL I X 覆盖缓冲液以形成双层。注意不要破坏双层结构，否则会稀释提取物并减少蛋白质产量。

(5) 26°C 孵育反应 20 h , 期间不要破坏双层结构。

(6) 蛋白质翻译水平可通过变性 SDS-PAGE 确定，肌酸激酶作为内参。

透析反应实验方案

(1) 用双层反应实验方案中第（1) 步 描 述 的 翻 译 混 合 物 50uL 溶 解 纯 化 的 m R N A沉 淀 。

(2) 将翻译混合物放入 12 k D a M W C ◦ 透析杯中。

(3) 制 备 储 备 透 析 缓 冲 液 ，混 合 6.5 m L Milli -Q 水 、2.0 m L 5 X 反 应 缓 冲 液 和1.5 m L 的 2 m m o l / L 未标记氨基酸。超 声 混 合 液 5 m i n ，然 后 用 0.2um滤器过滤。将2.5 m L 储备透析缓冲液加到 2 4 深孔板中的每个孔中。

(4) 将透析杯悬浮到储备透析缓冲液中。注意在透析杯下不要有起泡, 否则会影响添加物的补给。

(5) 用 Saran 包装膜 (Saran wrap) 覆 盖 2 4 深孔板以阻止储备透析缓冲液蒸发。 26°C孵育翻译反应 16 h 。

(6) 蛋白质翻译水平可通过变性 SDS-PAGE 确 定 ，肌酸激酶作为内参。

密度梯度超速离心纯化

图 37. 4 显示了纯化含有膜蛋白 (小麦胚芽无细胞翻译技术生产) 的脂蛋白体示意图。在密度梯度装配好后，一步离心可以将脂蛋白体与无细胞提取蛋白质分离开。在大多数情况下, 脂蛋白体在 3 0 % A c c u d e n z 溶液和上层缓冲液的分界面被极大的浓缩。

质再水化缓冲液的分界面上。
(6) 用 变 性 S D S - P A G E 分析各个组分的蛋白质含量。