ras2抑制基因的分离实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	葡萄糖 SDS TE 缓冲液乙酸裡大肠杆菌细胞 PEG3350 EDTA 质粒文库DNA
仪器、耗材	无菌绒垫微离心管 YPD 平板 96孔板

步骤

第 1 天典型抑制基因搜寻指导老师已经在一对YPD 平板上划出了突变株（菌株8-2供 1、 2、 3、 4 组使用；菌株 8-3供 5、 6、 7、 8 组使用）。用 YPD 平板，接 30〜40个单菌落作为原始平板，每个菌落约占1cm2, 30°C 下培养。完成原始平板划线后，用一块划线平板与使用具有对应匹配的突变搜寻菌株的实验组交换一块平板，将这块平板冷藏备用。高拷贝抑制基因搜寻： r a d 突变株于5mlYPD液体培养基中30°C过夜培养。第 2 天典型抑制基因搜寻将 YPD原始平板先后影印到一块YPD平板和两块YPAc平板上，轻轻地影印使背景生长减少到最小限度。给指导老师一块影印平板供紫外线处理（使用 Stratalmker， 7500“）。两平板在30°C培养。高拷贝抑制基因搜寻上午，将 5 0 0 4 静止的r a d 突变株液体培养液稀释到装有50ml YPD 的锥形瓶中，培养 6〜7h 直到细胞密度约为2 X 107 个/ml。完成 9 个转化，每个转化使用ljugYEp URA3 文库DNA; 另一个对照转化使用lpg Yep24 DNA。将转化后的菌液涂在10块 Cas-ura+ 乙酸盐平板上，在 30°C培养。第 6 天典型抑制基因搜寻可见小菌落长出，统计诱变平板和未诱变平板上的小菌落数量。从经紫外线处理或未经处理的平板中挑取单个菌落并转接到一个新鲜Y P D 原平板，挑取 15〜30个小菌落。小心挑取以免周围细胞的污染（正规的方法将通过单菌落划线纯化小菌落，为了节约时间省略这些步骤）。每批编号，并记录小菌落来自哪个平板（紫外线处理或未处理的），包括不同批的亲本菌株和在原平板的i^A S S 对照菌株8-6,在 30°C下培养。将从邻组得到的菌株（菌株 8-2供 1、 2、 3、 4 组使用；菌株 8-3供 5、 6、 7、 8 组使用）于 5m lY P D 培养基中培养。第 7 天典型抑制基因搜寻从 5ml过夜培养物中取20〇 4细胞均匀地涂在一块SC-his-trp平板上；将该平板置于水平表面，使其表面干燥。将 YPD原平板分别影印到2 块 YPAc平板、 2 块 YPD平板和事先准备好的、长有

ras2 菌苔的SC-his-trp平板上（确定这一步最后做）。一块 YPAc平板和 YPD平板于 3〇 °C下培养，其余于37°C下培养，杂交平板于30°C下培养。第 8 天典型抑制基因搜寻记录 30°C和 37°C的菌落生长情况，保存 30°CYPD平板备第12天使用。选择欲作详细分析的12个回复突变型（ revertant)，把这 12个回复突变型与培养在SC-his-trp 平板上的菌株交叉划线，同时也把r a d 亲本与r a d 菌株交叉划线，每个平板可以划 4〜6 个交叉。这些平板置于30°C下培养。高拷贝抑制基因搜寻此时转化平板上已有菌落长出。挑取 8 个菌落，接种到2mlCaS-um 液体过夜培养物中，小心挑取以免挑到转化平板上周围的细胞。同时，使用 1/4的 Y PD 平板将每个菌落作单菌落划线，于 30°C下培养这些平板。注意，正规的方法应在这步之前使用一块新鲜平板纯化菌落，为了节约时间省略这些步骤。第 9 天高拷贝抑制基因搜寻按 “技术和方案3C， lOmin制备酵母DNA” ，使用 2m l过夜培养物，从携带有高拷贝抑制基因的菌株中分离DNA。取 5^1转化适当的大肠杆菌，在 LB+ Amp平板上涂板。第 1 0 天典型抑制基因搜寻为了测定抑制基因是显性还是隐性，从每块SC-his-trp划线平板上挑取2 个单菌落 (双倍体），分别涂于Y PA c和 Y P D 平板，同时还应包括亲本与菌株交叉划线平板上的一个菌落。平板于30°C下培养。高拷贝抑制基因搜寻从大肠杆菌转化子中挑取每一个高拷贝基因的一个菌落，于 5ml LB+ Amp培养基中，在 37°C下开始过夜培养。将抑制基因的YPD 划线平板影印到2 块 5-F0 A 平板上，以选择丢失了高拷贝抑制基因质粒的细胞。这些可以被用来确定抑制作用是依赖于质粒的存在的。第 1 1 天高拷贝抑制基因搜寻少量抽提高拷贝抑制基因的质粒DNA，按 “技术和方案2， ‘ 快速和简略的’ 酵母菌落质粒转化法”将质粒 D N A转人突变菌株中。将每个转化产物的一半涂于 Cas-um平板上，另一半涂于Cas-ura+ 乙酸盐平板上，于 30°C下培养。同时还应包括一个 ljugYep2 4 D N A的对照转化，将转化产物的一半涂于Cas-ura平板上，另一半涂于 Cas-ura+ 乙酸盐平板上。实验八抑制基因的分离

第 1 2 天典型抑制基因搜寻统计Y PD 和 Y PA c平板上的菌落生长情况，测定哪些抑制基因是显性的，哪些是隐性的。取出第8 天保存的YPD 平板，在平板上用m泛亲本菌株和8〜10个隐形抑制基因菌株做平行划线，作为划线原始平板（附录D，平板划线模板），于 30°C下培养^ 高拷贝抑制基因搜寻为了鉴定带有i?AS2 基因的抑制基因，以每一个高拷贝抑制基因少量抽提的DNA 作为模板设计一下多聚酶链式反应（ PCR): lpl 1 : 10稀释的少量抽提的DNA 5M1 lOXTaq缓冲液 5jul 2mmol/L dNTP 混合物 5jul 5ymol/L DAo-RAS2-l 引物 5 4 5|umol/L DAo-RAS2-2 引物 ljul Taq 28^1 H 20 使用以下 PCR 参数： 94°C ， 4min—94°C ， lmin， 25 个循环—55°C ， 1〇 1丨11->72。 (：， 1. 5min—72°C ， 20min—4°C长时间保温。每个PC R 反应取5jul上样于1% 的琼脂糖凝胶，由指导老师提供的i?AS2 阳性反应作对照。如果抑制基因带有i?AS2 基因，则预期将看到约为1.5k b 的 PC R 产物。那些不带有i?A S2 基因的质粒将被送去测序，使用 DA〇-YEp24-l 和 DA〇-YEp24-2引物，可鉴定质粒中文库插人片段的末端序列。将第 10 天的 5-FO A平板影印到2 块 Y PA c平板上，于 30°C下培养。第 1 3 天典型抑制基因搜寻为了设计隐性抑制基因的互补组分析，将第 12天的划线原始平板影印到2 块 YPD 平板，标记好划线。用一块划线原始平板与使用对应杂交型菌株开始抑制基因搜寻的小组交换一块平板，于 30°C下培养。第 1 4 天典型抑制基因搜寻为了进行互补组分析需做杂交实验，将两块划线平板中的一块平板以垂直正交的方式影印到另一块新鲜的YPD 平板上，于 30°C下培养。第 1 5 天典型抑制基因搜寻将第 14天的交叉划线平板影印到一块SC-his-trp平板上，于 30°C 下培养以为互补则验筛选双倍体。

第 1 6 天典型抑制基因搜寻从 SC-h1S-trp平板上划线重合区挑取菌体，在 SC-his-trp平板上做划线原始平板。第 1 7 天典型抑制基因搜寻将第 16天的划线平板（ SC-his-trp) 影印到Y P A c和 YPD 平板，于 30°C下培养。高拷贝抑制基因搜寻统计第12天影印到Y PA c平板上的丢失高拷贝抑制基因质粒的菌株。如果这些菌株在YPA c平板上生长出来，则抑制作用不是质粒依赖的，菌株中的质粒不是我们感兴趣的。统计高拷贝抑制基因允许m泛突变株在乙酸盐培养基上生长的能力。注意， YEp24对照菌株本应在Cas-um培养基上生长，而在CaS-ura+ 乙酸盐培养基上不生长。如果事实上候选质粒是高拷贝抑制基因，那么它将使所有转化的细胞能在乙酸盐培养基上生长。此时，可能已经获得了抑制基因质粒中插入片段的末端序列了。使用酵母基因组数据库(http://www.pathway,yeastgenome.org/)确定基因组基因座和负责抑制作用的区域中的潜在基因。在你自己的实验室中，单个的幵放可读框将被亚克隆到2ju质粒上，再次检测基因的高拷贝抑制基因，以确定真正的抑制基因。第 1 8 天典型抑制基因搜寻统计第17天的平板上双倍体菌落的生长情况。你期望无法互补的抑制基因将会产生什么样的表型？你的突变子中是否有和来自邻组的突变子属于同一互补组？你有多少互补组？

来源：丁香实验

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