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    酵母转化实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    仪器、耗材
    产孢子平板SC-ura平板YPD 平板

    步骤

    第 1 天 把菌株5-1接到YPD 平板上，在 30°C下培养。 第 3 天 上午，把菌株5-1单菌落接种5m l的 Y PD 进行活化，在 30°C 下振荡培养。晚上， 用血球计数器测定细胞浓度。假定増殖一代的时间约需l 〇〇min，计算加到100ml YPD 中的预培养物的体积以便在第4 天上午10时使培养物细胞浓度达到2X 107 个/ml。 第 4 天 ' 用离心机以2000r/min离心收集细胞，按 “技 术 和 方 案 1， 酵母的高效转化”的 LiA c转化法，在下列条件下转化菌株5-1。 '实 验 受体菌 DNA 酶解 选择培养基 A 5-1 PJS801 无 SC-ura 5-1 PJS801 N co I SC-ura 5-1 PJS801 E coR I SC-ura B 5-1 pRS316 无 SC-ura 5-1 pRS426 无 SC-ura 对照 5-1 无 无 SC-ura 影印平板上P JS 8 0 1 转化子到S C -le ii和 S C -u ra平板上
    第 7 天 1 ) 为分析转化子，把它们与测试菌株杂交。对 于 PJS801转化子，用无菌牙签或接种环 从每个转化板上仔细挑取两个Ura+ LeU+ 菌落，与测试菌5-4在 Y P D 平板上混合。 减数分裂稳定性通过与测试菌5-3杂交形成二倍体来测试。用 一 个 pJS801Nc〇 I 转 化子杂交测试菌株5-3。对 pRS3 1 6 和 pRS426转化子，仔细挑取两个Ura+ 菌落， 并与测试菌5-3在 YPD 平板上混合。在 30°C下培养过夜。 2 ) 有丝分裂稳定性测定要求在转化平板上把转化子从未转化的细胞中纯化出来。纯化 两 个 从 工 切 点 整 合 的 转 化 子 （ 实验五A 在 第 4 天），在 SC-ura平板上用划线法 纯化PRS316和 pRS426质粒转化子（ 实验五B 在 第 4 天）。在 30°C下培养。 第 8 天 把含有杂交菌的YPD 平板影印到下面描述的适当的选择培养基上。仅使杂交形成 的二倍体细胞能够在选择平板上生长，在 30°C下培养。 转化子 测试菌 选择培养基 整合位点 5 -1 + PJS801 (未切） 5-4 SD 5 -1 + pJS801 (N co I ) 5-4 SD 5 -1 + pJS801 (E coR I ) 5-4 SD 减数分裂稳定性检测 5 -1 + pJS801 ( N c o l ) 5-3 SD+ his+leu 5 -1 + pRS316 5-3 SD+ his+leu 5 -1 + pRS426 5-3 SD+ his+leu 第 9 天 1 ) 制备孢子，把生长在选择平板上的二倍体接到Y P D 平板上，室温培养1 天。 2 ) 从来自 S C -u ra平板上纯化的转化子单菌落中用牙签取细胞接到5ml Y P D 培养液中 (全部6 种培养物），在 30°C下振荡培养过夜。 第 1 0 天 1 ) 把二倍体菌落从Y P D 转接到产孢子培养基（ 分别用液体和平板培养，比较孢子形成 的效率），室温培养几天。 2 ) 对过夜培养的5 m lY P D 培养物用无菌水做系列稀释度，涂 Y P D 平板，尽量控制在 100〜3 0 0 个菌落/平板，在 30°C下培养。 第 1 3 天 1 ) 开始解剖包括转化子在内的杂交四分体。对每个杂交实验，解 剖 10个四分体。四分 体平板均在30°C下培养。 2 ) 把拥有适当数量菌落的Y P D 平板影印到S C 和 SC-m ra平板，在 30°C下培养
    第 15〜 1 6 天 1 ) 当四分体在解剖板上长好后，影 印 PJS801转化子与菌株5-4的 杂 交 体 到 SC-um、 SC-leu和 Y P D 平 板 上 ，在 30°C 下 培 养 并 测 定 U R A 3 和 L E U 2 的 分 离 。对于 PJS801、 pRS316和 pRS426转化子与菌株5-3的杂交体，影印平板到SC-ura平板上 来监测质粒分离/稳定性，影印到SC-trp平板上来测定着丝粒的分离。 2 ) 统计经过在YPD 平板上非选择性生长后，保 留 Ura+ 性状的细胞数。

    来源：丁香实验

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