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        光化学增强基因转运

        相关实验:用于光指导的基因传递的光化学内化技术实验

        最新修订时间:

        原理


        材料与仪器

        步骤

        光化学增强基因转运

        材料

        试剂

        准备转染的细胞

        适当的细胞培养液

        核酸或重组病毒

        在使用之前用细胞培养液新鲜稀释核酸(如 DNA 多聚物),用无血清的细胞培养液或 PBS按照感染滴度新鲜稀释重组腺病毒、腺相关病毒或其他可能内吞的病毒。

        DNA 或病毒载体的使用数量要根据细胞株和载体的具体情况定。我们推荐使用 D N A 浓度为 0. 2〜5ug/ml, 病毒的起始感染滴度为 5 个感染颗粒/细胞。

        磷酸盐缓冲液(PBS)

        光敏剂: AIPcSai或TPPS2a (Porphyrin 产 品 , Logan, U tah )
        光敏剂的储存溶液的配置:溶 解 5 m g 的 A I P c S 2 a 或 2 m g 的 T P P S 2 a 于 0. 2 ml 0 •l m o l / L 的NaOH 中, 用无菌 PBS 加至终体积为 i ml。过滤除菌,分装,储存于-20℃, 最 长 6 个月。使用光敏剂溶液时要注意避光。也要避免长时间的储存或反复冻融,否则会造成光敏剂聚合 ,导致效果下降。光敏剂溶液如果溶解不完全可以用超声仪处理几秒钟。

        氢 氧 化 钠(N aO H ; 〇. l m 〇 l/L )

        仪器

        CO2 培养箱, 37°C

        光源, 670nm (AIPcS2a) 或 420nm (TPPS2a): LumiSource (PCI Biotech, AS,Oslo, Norway)

        细胞培养皿

        方法

        简单的实验计划,参见图 2B。

        1.接种细胞于细胞培养皿中,使细胞贴壁。

        培养皿的选择根据分析方法而定。例如,如果用流式细胞仪考察细胞的转基因表达效率,则可采用 12 孔板,每孔铺 75 000 个细胞。

        2.准备工作浓度的光敏剂,在使用之前用细胞培养液稀释。用 5〜20ug/m l 的 AIPcS2a或 0 •2〜lug/ml 的 TPPS2a。

        光敏剂浓度要根据光源、光强和光敏剂的吸收谱覆盖的波长范围定。要确保所有的步骤都在非激发光下操作以避免不可控的光敏剂激活,保护细胞不受光化学伤害。体外实验时可以关掉实验台的灯。

        3.移除细胞培养液. 并加入含光敏剂的细胞培养液。在 37°C , CO2 培养箱中培养16〜18 h 。

        4.移除含光敏剂的细胞培养液,用无光敏剂的细胞培养液洗 3 次。继 续 37°C 培 养 4 h。

        在此期间,在指定的时间点加入核酸(如 DNA 多聚物)或重组病毒载体溶液。推荐的培养时间是:非病毒基因载体 3. 5 h,重组病毒载体 30 min。
        如果用光化学内化转运药物,同时加人光敏剤和大分子药物然后孵育细胞(如在移除光敏剂之前培养 18 h)。然而,核酸转运时推荐先加光敏剂孵育然后加核酸。

        5.移除载体并洗一遍细胞。 37°C , CO2 培养箱中孵育 30 min。

        6•将细胞曝光,采用的光剂量依据前言中的介绍来确定。

        如果想降低细胞膜的损伤,在无光敏剂中培养细胞 1〜4 h 后再曝光。

        7•将细胞放在黑暗环境中继续培养 24〜48 h 后分析转基因效率。

        来源:丁香实验

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