荧光基因分型筛查微小亚端粒重排实验

一、端粒卫星的 PCR 扩增

1.将引物置于冰上融化后轻轻混匀，稍离心。

2.对于每个标记物，准备 12 个反应的混合液包括：196μL 高压蒸馏水、32.5 μL 10XPCR 缓冲液、9.75μL 氯化酶、32.5μLdNTP 混合物、正反向引物各 2uL 和 1U Taq 酶，在冰上操作和保存。

3.将上述 15uL PCR 反应混合液加到 10uL DNA 中，用铝箔胶盖密封 96 孔板。

4.扩增前将 96 孔板放到热循环仪上，94°C 变性 5 min。

5.循环条件为 94°C、30s，55°C、30s 和 72°C、45s，共进行 35 个循环，最后的延伸时间为 72°C、7 min。样品可在- 20°C 保存备用。

二、PCR 鉴定

1.凝胶电泳：取 3uL 上样缓冲液与 5uL PCR产物混合，上样到含有 5mg/ml EB 用 1XTBE 配制的 1.5% 琼脂糖凝胶上。

2.使用合适的分子质量标准，在 100V 电压下电泳 30min。

3.将电泳后凝胶移到紫外透射反射仪上观察 DNA，确保微卫星的正确扩增。

三、扩增产物的凝胶分析

1.按照 ABI 自动测序仪手册所列方法，把玻璃板和隔板放到指定的盒子里。

2.将 3 mL LongRanger 凝胶溶液和 3 mL10X TBE 混勻，加10.8 g 尿素，溶解后加去离子水至 30 mL，用 0.45um 滤膜过滤。

3.加入 150μL ,10% 的 APS 和 21μLTEMED 后倒胶，使凝胶聚合 lh。

4.按说明书将凝胶盒装进测序仪。

5.按表 2 所示在 PCR 扩增后将等量的每种扩增产物混合在一起（见注释 3)。

6.新鲜配制上样混合液：0.5μLGS-400 HDROX、1xL 上样缓冲液和 5 ml 去离子甲酰胺。

7.将 2μLPCR 产物混合溶液与 3pL 上样混合液混匀。

8.90°C 变性 3 min 后，快速放到冰上。

9.将样点人胶孔中。

10.应用运行 GS36D2400 模块搜集数据。

11.按产品手册说明用 GeneScan 软件进行数据分析。

12.用 GenoTyper 软件确定等位基因的大小。

注释

1.研究表明：细胞遗传学难以辨认的非平衡易位是导致 CT 地中海贫血智力障碍综合征（ATR-16[16])、Wolf-Hirchhorn 综合征 [17]、Miller-Diecker 综合征 [18] 和猫叫综合征（cri-du-chatsyndrome)[19] 智力障碍的原因。

2.用此方法可能会出现的问题是如何确定端粒重排导致的表型。当有一个以上的受累子代、端粒重排与智力障碍共分离时这种关系是明确的。在缺乏智力障碍家族史的条件下，当重排涉及以前智力障碍病例缺失的区域，或者当缺失片段非常大时，就可获得端粒重排的生物学效应证据。在其他病例中，确定小端粒重排的致病性可能更加艰难。

3.为了使获得的所有位点峰高一致，可能需要调整每次混合的比率。