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        髙通量方法筛选聚合物转染试剂

        相关实验:筛选聚合物转染试剂的高通量方法

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        髙通量方法筛选聚合物转染试剂

        材料

        试剂
        Bright-Glo Kits (Promega)

        C0 S7 细胞,一种非洲绿猴的肾成纤维细胞系,适合被需要表达SV40 T 抗原的载体 转 染(ATCC: CRL-1651)

        二 甲 亚 砜(DMS0, >99. 7% 无菌 过 滤)(Sigma-Aldrich)

        DMEM 培 养 基 [每 500 ml 含 50 ml 胎 牛 血 清(F B S ) 和 5m l 青 霉 素 - 链 霉 素 (Invitrogen 21063-029, 10082-147, 25200-056)

        蜜 火 虫 莖 光 素 酶(Prom e g a )

        p C M V - Luc D N A (l m g / m l 水 溶 液 ,一 20°C 储 存 )(ElimBiopharmaceuticals)

        支 化 P E I ,分 子 质 量 25k D a (Sigma-Aldrich)

        乙 酸 钠 溶 液(3mol/L , p H 5.2, 0.2um 膜 过 滤 )(Sigma-Aldrich)

        膜 蛋 白 酶(Invitrogen 25200-056)

        仪器

        12 道 吸 液 器(V&~undefinedP Scientific) , 高压蒸汽灭菌

        离 心 管(15 ml, 无菌)

        96 孔 板(Corning CJstar 3695),在带层流的细胞培养超净台 U V 照 射 I h 消毒

        细胞计数板(VWR)

        培 养 箱(37°C , 5% C 〇 2; FormaScientific)

        小 离 心 管(1.5 ml,无菌; Eppendorf, VWR)

        微量移液枪(Eppendorf)

        5〜50ul 1 2 通道

        50〜300ul 1 2 通道

        100〜IOOOul 单通道

        2 0 〜200ul 1 单通道

        涡旋振荡器(备选)

        移液枪头,高压蒸汽灭菌 30 min

        1〜200ul 4 盒(U. S. Scientific)

        100〜 IOOOul (U. S. Scientifio)

        移液池,无 菌(VWR)

        细 胞 板(96 孔)

        多孔平底带盖板(2 块; BDFalcon, 无菌, BD 353072)

        多 孔 板 , 96 孔(2.4m l), V 形 底 , Greiner Polypropylene (Sigma-AldrichM1561)

        组织培养板,白色 96 孔 板(无菌; Corning Costar 3917)

        营光素酶板计数仪(Perkin Elmer)

        计 时 器(VWR)

        组织培养滤器, 500 ml, 0.2 um 醋酸纤维素膜(无菌; Nalgene)

        水浴,室温

        方法

        所 有 的 操 作 都 必 须 在 层 流 细 胞 培 养 超 净 台 中 完 成 ,所 有 试 剂 和 设 备 均 经 无 菌 处 理 。我 们 假 定 读 者 熟 悉 基 本 的 无 菌 细 胞 培 养 技 术 ,包 括 细 胞 生 长 、传 代 和 接 种 细 胞 。

        1.在 转 染 前 一 天 , 以 每 孔 1.5 X IO4 在 白 色 细 胞 培 养 9 6 孔 板 接 种 C 0 S -7 细 胞。

        2 . 在无菌的小离心管中,用 200ul DMSO 溶 解 20m g 不同聚合物,制 备 100 mg/m l 的聚合物溶液。用 Iml DM SO 溶 解 IOmg P E I,制 备 lOmg/m l 的 P E I 溶液作为阳性对照。

        3 . 用 495. 8m l 蒸馏水稀释 4.2m l3mol/L 的乙酸钠溶液,配 置 500m l25 mmol/L 的乙酸钠 缓 冲 液(pH 5. 2),用 Nalgene 组织培养过滤器真空过滤除菌。

        4 . 吸 取 30 ml 25 mmol/L 乙酸钠缓冲液到移液池中,用多通道移液枪在 BD Falcon 9 6 孔板 的 A 和 B 排 中 分 别 加 人 l 76ul 和 8 〇ul 上 述 缓 冲 液。按这一操作方法 ,最终聚合物和 D N A 比例将分别为 20 : 1 和 1 〇〇 : 1。此 外 ,在 Greiner 9 6 孔 V形底板的 A 排中,每孔加入 900ul缓 冲 液。

        5 . 室温水浴解冻 pCMV-Luc D N A 储液,在 15m l 无菌离心管中,用 9. 4 ml 25 mmol/L的乙酸钠缓冲液稀释 600ul lm g /m l 的 D N A 储液。将稀释的 D N A 溶液转移到移液池中,向 96 孔板每孔加25ul )。

        6•在 37°C 水浴温浴培养液 15 min。转移培养液到移液池中,在 BD Falcon 9 6 孔板中每孔 加 入 200u l 培 养 液。

        7•在 Greiner 9 6 孔 板 的 A 排(含 900ul乙酸钠缓冲液),对 应 加 人 lOOmg/m l 的聚合物/DMSO 溶液和阳性对照,每 孔 100ul (图 1,板 1)。用移液枪混勻以确保聚合物溶解均匀。

        以下所有转移操作均用 12 通道移液枪完成。

        8 . 准备聚合物稀释液(图 1 , 步 骤 1):

        a. 从 Greiner 9 6 孔板 的 A 排 转 移 24ul聚合物溶液到含有 176ul乙酸钠缓冲液的聚合物溶液稀释板的 A 排中。

        b•从 Greiner 96 孔 板 的 A 排 转 移 120^1 聚合物溶液到含有 80ul 乙酸钠缓冲液的聚合物溶液稀释板的 B 排中。

        c. 用移液器吹打溶液,确保溶液混合均匀。

        9 . 准备聚合物-D N A 复 合 物(图 1 , 步 骤 2)

        a. 从聚合物溶液稀释液板的 A 排 ,转 移 25m1 聚合物溶液,依次加人到含 25ulDNA 的 DNA 板 的 ABCD 四排中。

        b. 从聚合物溶液稀释液板的 B 排 ,转 移 25W 聚合物溶液,依次加入到含 2 5 4D N A 的 D N A 板 的 E F G H 四排中。

        c. 计 时 5 min。每一次转移均用移液枪反复吹打,以确保溶液混合均勻并促进聚合物-DNA 结合。每次加样前要换枪头,防止孔间污染。混合技术对获得可重复的转染结果非常重要。

        10.5m in 后 ,从 D N A 板 的 A 排吸取 30M1 聚合物-D N A 复合物,加人到每孔含 200ul 培养液的培养液板的 A 排 中 (图 1,步 骤 3),依次重复其他排的操作。每一次加样均用移液枪吹打几次,确保溶液混合均勻。每次加样要更换枪头,防止孔间污染。

        11•将聚合物-DNA 复合物加人到细胞中 (图 i ,步 骤 4)。

        a. 用 12 通道的吸液器吸去整块细胞培养板的培养液,确保培养液吸净。

        b. 从培养液板的 A 排中,吸 取 I 5O mI 聚合物-DNA 复合物到细胞培养板的 A 排中。

        c•依次重复其他排的操作。每次加样更换枪头。加样时,枪头与细胞培养板成一角度,沿孔壁加人,避免直接在细胞的上方加样,以减小加样带来的液体流动和涡旋力,从而避免将细胞冲悬。

        d. 将细胞放回到培养箱中,计时培养 lh 。

        12.I h 后,从细胞中吸除聚合物-DNA 溶液,每 孔加人 105ul 新鲜培养液,继续培养细胞。

        13•分析萤光素酶蛋白的表达。萤光素酶蛋白表达的分析通常在转染后 1〜5d 进行,对于 CO& 7 细胞,转染后 3d 比较合适。

        a. 室温水浴解冻 Bright Glo Luciferase Assay Kit 至少 lh 。

        b. 将缓冲液加入到底物管,盖好,倒转几次以混勻,转移到移液池中。

        c•用多通道移液枪,在细胞板每孔中加人 100ul 溶液,加完后,计 时 2 m in , 轻摇板 ,或用涡旋振荡器混合。

        d. 2 min 后 ,在读板仪上测量萤光强度, 时间为 Is 。对应于标准曲线,计算萤光素酶蛋白表达的量。

        来源:丁香实验

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