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        电转染哺乳动物细胞

        相关实验:优化体外哺乳动物细胞的电转染

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        电转染哺乳动物细胞

        材料

        试剂
        细 胞 培 养 基 (完全培养基和无血清培养基) 待转染细胞系 电穿孔缓冲液 商业电穿孔缓冲液列于表1 , 按照制造商的介绍储存这些缓冲液。非商业电穿孔缓冲液配 方 如 表 3 所 示 ,使用前无菌过滤并在室温下储存。 磷酸盐缓冲液(P B S ) 质粒 D N A 柱色谱纯化。 I X 胰蛋白酶- E D T A (0.05%) 表 3. Noncommericiair自制”)电穿孔缓冲液的构成 电穿孔缓冲液名称 电穿孔缓冲液的组成 设计者 Hypo~osmolar 缓冲液 kC l(25m m ol/L ) Zimmermann( 1996 ) Iso~osmolar 缓冲液 KH2PO4CO. 3m m ol/L) K2HPO4CO. 85m mol/L) My〇-inositol(90m O sm /kg,pH 7. 2) P ulsing缓冲液 KCl(125mm 〇l/L ) NaCl(15mm ol/L) 葡萄糖(3m m ol/L) H EPES(25mm ol/L) MgCl2(I . 2m m ol/L, pH7. 4) Li et al. (2002) 仪器 电 穿 孔 管 ( B TX In stru m e n ts, Bio-R a d , In v itro g en , A m axa 或 T herm ol E lectro n ) 用于哺乳动物细胞电穿孔管通常宽lcm , 内 径 为 4mm。内 径 为 2m m 的电穿孔管可用于减 少脉冲持续时间.。 电 穿 孔 系 统 (表 2) •3

        方法

        准备待电穿孔的细胞

        1 . 在电穿孔前 24〜72 h ,将细胞分离并在合适的含血清的完全培养基中培养。
        这步操作要保证细胞健康并有高增殖能力,这将增强细胞对电穿孔的耐受力并提高电转染的效率。

        2•当培养的细胞达到对数生长中期或者末期时(或 者 60%〜90% 覆盖率),收集细胞。

        对于黏附细胞,用 IX 胰蛋白酶-EDTA 溶液(预热到 37C ) 消化,然后室温下用 P B S 或者其他清洗缓冲液洗一次。

        3.20°C , 250 g 离 心 5m i n 收集细胞。用电穿孔缓冲液重悬细胞至细胞密度为每 i 〇〇ul 5X 105〜5X 106 个细胞。

        4 . 将 2〜IOug DNA 和 IOOmI 细胞悬液混合,转移到电穿孔管中。

        虽然有些时候推荐在电穿孔前解育细胞和 D NA 的混合物,但并没有必要。这步操作应该在室温下进行。

        电穿孔

        5•轻敲装有 DNA 和细胞的电穿孔管(细胞在管中放置了一段时间后会沉淀),然后置人电穿孔槽中。

        6 . 选择合适的电穿孔仪参数并开始电穿孔。

        7•电穿孔后立刻向管中加入 500〜900ul完全培养基,并将电穿孔过的细胞转移到合适的培养器皿中(如 6 孔板)。加入培养基维持细胞继续生长。
        对于稳定转染,只需从管中转移一部分电转染的细胞(1/10〜1/20 体积)到培养器皿中。

        8 . 在合适的生长条件下培养细胞过夜。如果发现明显的细胞死亡,更换完全培养基。

        基因表达分析

        9 . 如果实验的目的是稳定转染,直接跳到步骤 1 〇。对于瞬时表达,在转染 24〜72 h 后收集细胞,选用恰当的方式检测基因表达,如使用流式细胞术、 RNA 杂交、免疫或酶检测。如果转染的基因带有一段荧光标签,可以用荧光显微镜观察。

        1 0 . 获得稳定转染的细胞:在完全培养基中生长 48〜72 h 后 ,将细胞转移到合适的培养基。在合适的条件下继续培养细胞。

        操作和参数举例

        1•细胞和密度: IOOul 细胞培养基中含 IO6 个 S V E C (A T C C ) 细胞。

        2•转运材料: 2f x g p E G F P - N l 质粒 D N A (Clontech)。
        3 . 电穿孔缓冲液: D M E M 细胞培养基。

        4•准备:

        a•用胰蛋白酶-E D T A 消化细胞并用无血清的 D M E M 培养基清洗细胞一次。

        b. 室温, 250 g 离 心 5 min 收集细胞。

        c. 用 IOOmI D M E M 培养基重悬细胞并与 V g 质粒 D N A 混合。

        d. 将混合物转移到一个内径为 4m m 的电穿孔管中。

        e•将管置人 BTX ECM830 型电穿孔仪的电穿孔槽中,施 加 150V/c m 的短暂电压50ms

        来源:丁香实验

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