点赞

收藏

分享

基本方案3 成肌细胞移植到骨骼肌细胞

相关实验：基因传递到肌肉实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	灭菌的PBS 甲氧氟烷乙醇经灭菌的加入 PBS 中的 BSA 以 F-10 DMEM 为主要的成肌细胞生长培养基
仪器、耗材	有网格或分压器的玻璃房间或商用吸入室电动剪或锋利有齿的手术剪刀纱布或棉布注射器台式离心机

步骤

1. 通过反转录酶病毒转染成肌细胞（基本方案 2) 48h ，在移植前给细胞每12〜24h 换液。 2. 酶消化反转录酶病毒转染的成肌细胞并重悬于IOml F-10/DMEM-based初级成肌细胞培养基。细胞计数。 3.350发室温离心4111 丨 11 ，去上清，用51111?88重悬，再次离心，用1111丨？63重悬并转移至 I.5m l的小离心管中， 4500r/min离心 30s ，去上清液，并以 IO8 个细胞/m l的浓度用 0.5% BSA/PBS重悬，用移液枪吹散混匀。如果有许多小鼠要注射，请在 Ih 内完成。 4： a. inhalation cone的使用。通过挤压一弄皱了的]int-free棉纸到一个50m l圆锥螺旋拧盖的聚丙烯管做成一个Metofane吸入圆锥通风橱，添加几滴Metofane到棉纸里。抓住小鼠尾巴将小鼠提起几秒然后放进空试管中。小鼠最终将会爬进里面避免被悬空。保持一会直到小鼠失去意识。在之后的操作中，保持小鼠的头在试管中。如果试管保持封闭，就可以在几次试验中不换Metofane。注意：此步骤应该在通风良好的地方完成。如果检测到Metofane蒸气，应该观察合适的通风条件。 4b. inhalation chamber的使用。在通风橱中准备cham ber,用一块浸泡在Metofane中的棉纸或纱布使之置于格子下的玻璃chamber (不要用塑料的）中，或者其他 — 种将小鼠密闭其中的东西（ Metofane是一种皮肤刺激性物质）。将一只小鼠放人in_ halation chamber中并关上盖子。等待 Im in左右小鼠将会失去意识。将小鼠移至 inhalation cone (第4 a步）并在下面的步骤中保持小鼠的头在试管中。 5.对将注射的腿部进行去毛处理。出于快速高效不伤害皮肤的考虑，使用商业化的刮胡刀。选择性的使用锋利的一侧，拉紧后腿向上（与毛生长方向相反）进行去毛处理。如果需要可对失去意识的小鼠使用穿耳枪进行身份确认。 6•将小鼠放在一张干净的一次性bench paper上，用 7 0 % 乙醇消毒后腿。 7.用微量移液枪轻轻地吹散成块细胞上清液。用 50^1 Hamiliton注射器吸人细胞，按下面的操作避免吸入气泡。 8a. 侧腓肠肌注射。将小鼠侧放并使其头远离自己，用拇指和无名指持小鼠脚，并用食指和中指固定其腿部，标记侧腓肠肌的位置，从鼠腿的膝盖以下至踝关节背侧部。持针以45°角慢慢地刺入皮肤，将针推进在胫骨背部的肌肉中！W2mm深。慢慢°地注射5/^1至肌肉，几秒钟后慢慢拔出针头。如果你想在较原始的腿部肌肉达到最大的注射量，总体积5 0 4 , IO5 个细胞/^ 效果最好。这些细胞悬液可被分为1 0 次，每腿每次注射5^1，尽管悬液可能因为针的原因泄漏一部分。做为选择， 50jl J 悬液可以被分成尽量多的次数注射，每次约 1/^1。其结果使肌细胞与更多受体纤维组织融和，也许它将花费更多的时间并且引起更多的潜在的肌损伤。 8b. tibialis anterior注射。将鼠背朝下放置，慢慢地将它的腿拉直。标记 tibialisante_

rior的位置，小腿两块骨中处于内侧且较大的一块，从膝部延伸至踝部。找到膝盖骨，在膝盖向下至踝关节大概1/3处注射细胞。 . 9.将小鼠放到带有动物用草垫的笼子中，使其恢复知觉（一般在使用Metofane 2〜 5min 后）。备选方案 2 直接肌肉注射质粒 DNA 直接肌肉注射质粒D N A 的操作步骤与注射肌细胞步骤十分相似。成熟的步骤是将质粒用P B S 浓缩成 lmg/m l , 并以 5〜IOiUl体积注射。 D N A 的纯化步骤是很重要的，如果质粒被有吸附能力的柱状物纯化一一如 Q m g e n , 它必然将去除细菌内毒素（可以引起注射部位发炎）。 Qiagen销售的试剂盒可以在注射前一周用一小块干冰对将要注射部的肌细胞造成损伤，尽管这需要两次重复的切开和缝合。心脏中毒素和bupivacain也可在注射前对肌细胞造成损伤。然而，大部分调查人并没有做先期的操作而只是简单地注射 D N A 溶液。短暂地暴露注射过的肌肉于高电压下，可以加快D N A uptake效率。支持方案用 FA C S分离 ^ cZ-Iabeled细胞 F A C S 的细节见 Coligan 等（2004) 〇材料（标八的条目参见附录 1) 200m m o l/L 突光素納 di-( H>galactopyranoside (氟脱氧葡萄糖； 100X ; 分子探针）在 I : I (V /V ) DMSO/water (― 20°C 阴暗储存）细胞储存在： ZacZ表达细胞（见基本方案2 ) 和不表达的调控细胞 V F A C S 染色缓冲液，室温 37°C V F A C S 阻断缓冲液，冻存 V F -10-或者F-l()/D M E M 初级肌原细胞生长培养基胶原包被组织培养皿桌亩离心机（如 IEC H N -s n ) 荧光素钠激活的细胞分类机（如 Becton Dickinson FACStar) 注意：对表达细胞和不表达 ZacZ的调控细胞应平行地进行准备。 1. 融解 Ij ^J 200mmol/L F D G 于 9知1 水中， 37°C 水浴 2 . 取 IXlO4〜5 X 106 胰酶消化下的细胞， 4°C ， 350g 室温离心，之后用 IOOjUl F A C S 染色缓冲液重悬， 37°C水浴 IOmin后加 IOOjlJ 预热的F D G ， 37°C孵育 lm in。 3. 加 1.8m l 冰冷的F A C S 阻断缓冲液，置冰上。尽快保持细胞冰冷分开。 4•用荧光活性细胞分选仪检测forward s c a tte r,碘化丙啶F t 和荧光素。分离细胞，弃去 P I 阳性（死细胞）细胞和任何荧光阳性水平低于设定好的极限的细胞。如果细胞量不能到达两个可辨别的峰之间，使用对照细胞样本去确定背景荧光水平。 5.用分选仪沉淀设定好的细胞于一个F-10-或 F-10/D M E M -based肌细胞培养基中（通常有 5 % 〜1 0 % 的细胞有最高的表达）。加到被沉淀的细胞里的培养基的量依据期望的分选的细胞数；尽量在适度地高密度水平分选这些细胞。 6•将分选的细胞铺在胶原质包被的皿中并转至培养箱中。

来源：丁香实验

ad image

ad image

相关产品推荐

胶原酶 NB 5 来源于溶组织梭菌，9001-12-1，EnzymoPure™, 灭菌级,≥ 0.10 U/mg，阿拉丁

￥4119.90

DMEM 培养基（高糖，无酚红，含胎牛血清，含Penicillin-Streptomycin）-【短效】DMEM Medium (High Glucose, Without Phenol Red , With FBS, Penicillin-Streptomycin)

￥1044

磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)，1×,pH7.2-7.4,,粉剂,不含Ca2+/Mg2+，阿拉丁

￥58.90

IFKine驴抗小鼠IgG二抗，绿色荧光标记（IF实验优化）

￥498

永生化人骨骼肌成肌细胞

询价

相关方法

基本方案1 小鼠肌肉原代细胞的分离和生长（没有细胞分类）

2024-05-13

基本方案2 反转录酶病毒感染初级成肌细胞

2024-05-13

基本方案4 对小鼠通过 quadricpeps 肌肉的肌肉注射进行 DNA 疫苗管理

2024-05-13

相关问答

问

结合传递

1 回答 355 围观

推荐阅读

骨骼肌细胞的微细结构

骨骼肌细胞的微细结构

骨骼肌细胞损伤模型的建立

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

丁香实验小程序二维码

实验小助手

丁香实验公众号二维码

扫码领资料

反馈

TOP

打开小程序