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基本方案高滴定度 HIV-I 基本载体转染 293T 细胞实验步骤

相关实验：高滴定度慢病毒载体产物实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	PBS CaCl2 杜氏改良培养基漂白剂 2 X HeBS TE 缓冲液
仪器、耗材	组织培养瓶过滤器乙醇喷壶组织培养皿培养箱灭菌离心管

步骤

1. 在 IOcm组织培养皿中用D M E M -10培养基培养293T 细胞， 37°C 培养箱10% C O 2 培养，每周3 次传代1 :4〜1 : 6 (如每个星期一、三、五）。 2 . 转染前2 天，准备10个皿，每个皿中接种2X 106 个 293T 细胞， 37°C 培养箱10% C O 2 培养过夜，隔天早上将细胞1 : 2 传代成 2 0 个 IOc m 的培养皿中，加 IOm I D M E M -10培养基培养，再 W C 培养箱10% C O 2 培养过夜。 3. 用 p H 8. 0 的 T E 缓冲液调整所有质粒D N A (如 p M D . G 、 pRRL-C M V -GFP-sin、 pMDLgag/polRRE、 pRSVrev) 浓度成 lmg/ml。 4. 将 100卩 1p M D . G 、 400卩 1pRRL-C M V -GFP-sin、 240卩1pMDLgag/polRRE 和 6 0jul

pRSVrev混合于I .5m l离心管中。这4 i 而要 20 个狐。母个jm■需要 5哗 pMD. G， 20哗 pRRL-CMV-GFP-sin， 12哗 pMDLg/pRRE 和 3吨 pRSVrev。 5. 下午进行转染，加 2 1 0 4 去离子水到 ~次性 L 5mi 离心管中，共 2〇个再加 i DNA 混合物打匀。。丹影 ¥ 6. 加 250^1 0. 5mol/L 的 CaCl2 到第5 步中的离心中混匀。 7. 加 25OW2XHeBS到 2〇个I 5mI 灭菌锥形离心管中，然后逐滴加人第6 步中的■ DNA/ CaCl2 混合物到离心管中，充分混勻。 8. 将制备的溶液室温放置3〇 min。 9•逐滴加第8 步中的溶液到20个第 2 步中的培养皿中。轻轻混匀直到培养基呈现均勻的红色。 10•将培养皿放置于5 % C〇2 培养箱中W C 过夜。隔天早上用10mi 新鲜 D M E M _1〇换液后， 37°C培养 28h。 11•收集上清液到50m l离心管中盖上盖子，用 70%乙醇消毒后带出无菌罩。 4。〇, 500g 离心 2min。 12. 连接 125m l过滤器到真空泵，过滤 i 〇〇 m丨培养基通过〇.45^m 的滤膜。用另外一个过滤^ 过滤剩下的IOOml培养基。将过滤的溶液置于75cm2 组织培养瓶中。 13. 可选操作：取 Im I于 i .5m l离心管中（支持方案丨和2)，于 4° C保存备用。滴足是随机的，当C lO 8T U A nl的时候最终滴定度很重要。这种情况下，就需要确定步骤中的哪步没有达到最佳。第 1 3 步中的样品滴定度决定载体产品是否可用。离心后滴定度< l 〇6TU/m l或回收率< 50% 都存在问题。比较第 1 3 和 1 8 步中的载体颗粒数目（由计算第一次离心后得到回收率得出），在离心前计算颗粒回收率和颗粒数目。颗粒数目是滴定度（ T U /m D 乘悬液体积（ mD，详见表 12 6 工14.转移过滤的培养基到6 个 30m l 的灭菌异质同晶聚合物离心管中，将离心管放于 S W 2^转子中，盖上超速离心机槽后带出无菌罩。 16X：， 721〇吆离心 9〇 _ 。 15•打开高速离心机的罩子。用镊子小心将管子取出离心机。倒置管子以把上清液移入一 75cm2 的组织培养瓶中。留少许上清液用来滴定（离心前病毒颗粒< 5 % 的应存留在上清液中）。在残留的上清中加入1/6体积的1 4 % 漂白剂，混匀，静置ih，去除。保持管子倒置，并用纸巾拭净管壁，以尽量除尽上清液。用镊子夹取纸巾。不要擦到管子的锥形底部。把空管子置冰上。加 600jUl的PBS。 16.用 Iml的 tip吹打20次以重悬载体沉淀，勿打起泡沫。置冰上3〇min。

17. 再吹打20次。将 6 管中的重悬载体颗粒共同放入一个5m l 离心管中。加入适量 P B S 以充满管子。一轮离心即可为体外实验提供足够高的浓度。这样，载体颗粒被集中，分装入 0. 5ml 离心管，保存在一 80°C。 18. 用 I% - D M E M -10稀释5^1载体重悬液。将其保存在4°C 直至用来滴定（支持方案 1 和 2)。 19. 76 000g ， 16°C高速离心9〇 min。打开离心机罩子。用镊子取出管子，在一 50m l 离心管上倒置管子以去除上清液。留少许上清液用来滴定（离心前病毒颗粒< 5 % 的应存留在上清液中）。在残留的上清液中加入1/6体积的1 4 % 漂白剂，混勻，静置 lh，去除。擦拭管子（第 15步)。在管底加21〇4的P B S 。 20. 用 Iml的 tip吹打20次以重悬载体沉淀，冰上孵育2h。重复吹打以完成重悬。 21•用495M1D M E M - 10稀释 5/J 浓缩后的载体块。用 400^x1D M E M - 1 0 和 IOOjlJ 第一次的稀释液混匀。将这些1 : 100和 1 : 500稀释的悬液保存在4°C以备用来滴定（支持方案1 和 2)。用第 13、 18和 2 1 步保存的液体计算复苏百分比（表 12. 6.1是病毒纯化过程的典型结果）。 22•将第21步获得的浓缩液分10管， 204/管。一80°C 储存。支持方案 1 滴定慢病毒 G F P 载体株慢病毒载体的滴定程序很像其他载体（单元 12. 7 和 12. 8 疱疹载体及单元12. 3 腺相关病毒载体的滴定程序）。有几个参数可以影响载体表现出的滴定度，如用于靶细胞的细胞系、加入载体颗粒的培养基的体积、转染的持续时间以及有没有能帮助载体颗粒附着于细胞表面的多聚阳离子。此程序可用于任何细胞系。但是，有的细胞系转染效果较差，而且这里标TK的适用于H e L a 细胞的预期结果并不适用于所有细胞系。最好用 2M T 细胞替代H e L a 细胞，因为这种细胞系在实验室培养就是专门用来做细胞转染的。然而，就算 293T 细胞象H e L a 细胞一样转染效率高，它们的贴壁能力却较差。当然，这不是G F P 检测的问题（支持方案1)，而是 LacZ染色过程中应该特别注意的（支持方案 2)。不论如何，如果用 293T 细胞，在加入每种试剂时都必须特别小心地轻轻吹打。附加材料（基本方案） HeLa 细胞（ A T C C # CCL-2) 载体（基本方案） 0. 2 5 % 胰酶/0. 53mmol/L —E D T A (无染料. ； Life Technologies; 商业化 l〇，X 株 P B S 稀释） ' 6 孔组织培养板荧光细胞分析仪（ F A C S ; BectonDickinson) 及适用的管子 1•滴定前一天，在每个 6 孔板的孔中，用 2ml D M E M - 10 准确接种0 •5X105 数量的 H e L a 细胞，并保证细胞平均分布于孔板底部。每种载体株准备一个孔板做滴定用。 37°(：， 1〇%(：0 2 孵育过夜。

2•在5 个孔内，加入等量待滴定的载体液：用 5〇 y 和 25y 未稀释的液，及 1〇〇 ^ 、 5〇 4和 254按 1:50稀释的液（分别对应2.(^1、 1.(^1、〇.5] ^的未稀释液）。勿在另一孔内转染细胞，做空白对照。 3 . 在 F A C S 分析前，去除培养基，用 2ml P B S 洗一次，加入 50(^1无色胰酶 z 〇 • 53mmd/L EDTA。孵育5min以消化细胞。用 Iml tip吹打以打裂凝块。将细胞转至装有50〇4 P B S 的 FA CS管子里。如需要，可将一份细胞保持于培养状态。如 F A C S 分析在让内未完成，可以用 4 乂（ m /V〇多聚曱醒■溶液（见配方）固定细胞3〇 m in ，能在保存至少一周 4•通过F A C S 分析确定G F P 阳性细胞比例。 5.以下面公式计算滴定度，单位为转化单位（ T U ) /ml: (IXlO5 接种细胞X % G F P 阳性细胞）X ]000 载体4 数 ^ 为了做和确的滴定计异， 2 个连续稀释液在两周内转染后的G F P .阳性细胞数比值必须接近1 : 2 的预期值。当< 1 5 % 的靶细胞转化后，此线性化结果能被观察到。支持方案 2 滴定慢病毒 L a c Z 载体株含 L acZ 的载体（如 http://www.tronolab.unige.ch—些列表中的）最好是用检测 P-半乳糖苷酶的免疫化学方法滴定。标准96孔板很好用，因为在40倍放大的显微镜下，整个孔都清晰可见。细胞2吐内增多1 倍，则多数转化情况都是出现2〜4 个 &色细胞簇。单个蓝色簇很少，但是也有。蓝色细胞簇的数目必须要很少，以助于鉴定^ 个蓝色细胞簇是单个转化事件的结果。有 10〜1〇〇个蓝色斑点的孔可以计数转化事件。附加材料（基本方案；标_^/的条目参见附录1) H e L a 细胞（ A T C C # C C L -2) 载体（基本方案） (w A 〇多聚甲酸溶液 VXgal染色溶液 96孔组织培养板 37°C ， 10% CO2 增湿培养箱多级移液器和tip 倒置显微镜 1. 滴定前一天，在每个 9 6 孔板的孔中，用 200jul DMEM-1 0 准确接种 5〇〇〇数量的 HeLa细胞，并保证细胞平均分布于孔板底部。 37° C ， 10% C〇2 孵育过夜。每个、滴定都重复操作，做平行对照。 2. 在第二个纵列的孔里，加人用198JU 1DMEM-10稀释好的2/J 载体液（共 4〇〇jlJ)，第一列的孔做空白对照。 3. 用排枪做一系列的梯度稀释，从第二列孔开始取20 0 4 液体打入下一列，然后补足 4〇〇 W，依次稀释下去之至倒数第二列。每次都用枪吹打均匀。 37°C孵育 2df 〇 4. 检测L a c Z 阳性，去除j ;首养基，用 400jul P B S 洗一'次，用 250^1 4 % 多聚甲酸溶液准

确固定5min，用 P B S 洗两次，加入 250^1 Xgal染色液。 37°C 孵育，定期查看。 5 . 用 25CV1PBS替换X gaU 如果必要，在 4°C保存至少一周。 6. 在倒置显微镜下，在含有1〇〜1〇〇个蓝色斑点的2 个孔里计数转化事件。参考稀释因素区分转化事件，并乘1〇〇倍来求算滴定度（T U /ml)。

来源：丁香实验

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