相关实验：高滴定度慢病毒载体产物实验
最新修订时间：2024-05-13
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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![2•在5 个孔内，加入等量待滴定的载体液：用 5〇 y 和 25y 未稀释的液，及 1〇〇 ^ 、 5〇 4和 254按 1:50稀 释 的 液 （ 分别对应2.(^1、 1.(^1、 〇.5] ^的 未 稀 释 液 ） 。勿在 另一孔内转染细胞，做空白对照。 3 . 在 F A C S 分 析 前 ，去 除 培 养 基 ，用 2ml P B S 洗 一 次 ，加 入 50(^1无 色 胰 酶 z 〇 • 53mmd/L EDTA。孵育5min以消化细胞。用 Iml tip吹打以打裂凝块。将细胞转 至装有50〇4 P B S 的 FA CS管子里。 如需要，可将一份细胞保持于培养状态。如 F A C S 分 析 在 让 内 未 完 成 ， 可 以 用 4 乂 （ m /V〇 多聚曱醒■溶液（ 见配方） 固定细胞3〇 m in ，能 在 保 存 至 少 一 周 4•通过F A C S 分析确定G F P 阳性细胞比例。 5.以下面公式计算滴定度，单位为转化单位（ T U ) /ml: (IXlO5 接种细胞X % G F P 阳性细胞）X ]000 载体4 数 ^ 为了做和确的滴定计异， 2 个连续稀释液在两周内转染后的G F P .阳性细胞数比 值必须接近1 : 2 的预期值。当< 1 5 % 的靶细胞转化后，此线性化结果能被观察到。 支 持 方 案 2 滴 定 慢 病 毒 L a c Z 载 体 株 含 L acZ 的 载 体 （ 如 http://www.tronolab.unige.ch—些列表中的）最好是用检 测 P-半乳糖苷酶的免疫化学方法滴定。标准96孔板很好用，因为在40倍放大的显微镜 下，整个孔都清晰可见。细胞2吐内增多1 倍 ，则多数转化情况都是出现2〜4 个 &色 细胞簇。单个蓝色簇很少，但是也有。蓝色细胞簇的数目必须要很少，以助于鉴定^ 个 蓝色细胞簇是单个转化事件的结果。有 10〜1〇〇个蓝色斑点的孔可以计数转化事件。 附加材料（ 基本方案；标_^/的条目参见附录1) H e L a 细 胞 （ A T C C # C C L -2) 载 体 （ 基本方案） (w A 〇 多聚甲酸溶液 VXgal染色溶液 96孔组织培养板 37°C ， 10% CO2 增湿培养箱 多级移液器和tip 倒置显微镜 1. 滴定前一天，在 每 个 9 6 孔板的孔中，用 200jul DMEM-1 0 准 确 接 种 5〇〇〇 数量的 HeLa细胞，并保证细胞平均分布于孔板底部。 37° C ， 10% C〇2 孵育过夜。每个、滴定 都重复操作，做平行对照。 2. 在第二个纵列的孔里，加人用198JU 1DMEM-10稀释好的2/J 载 体 液 （ 共 4〇〇jlJ)，第 一列的孔做空白对照。 3. 用排枪做一系列的梯度稀释，从第二列孔开始取20 0 4 液体打入下一列，然后补足 4〇〇 W，依次稀释下去之至倒数第二列。每次都用枪吹打均匀。 37°C孵 育 2df 〇 4. 检测L a c Z 阳性，去除j ;首养基，用 400jul P B S 洗一'次，用 250^1 4 % 多聚甲酸溶液准](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470281491168xpcqbs585mpng_small.jpg)
