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基本方案短暂转染的假包膜反转录病毒的制备

相关实验：假包膜型反转录病毒载体的制备实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	质粒反转录病毒载体
试剂、试剂盒	293GP 和 NIH3T3 细胞的培养物
仪器、耗材	超干净的离心管宽嘴离心瓶超速离心机灭菌无热原的注射器式滤器 G S A 转子聚丙烯管细胞培养皿

步骤

1•克隆（单元 12. 4 ) 目的基因进入修饰的反转录病毒载体如图12. 5.1所示，用 C M V I E 启动子代替V L T R 的 U 3 区。2 . 用 Beckman polyallomer (聚丙烯和聚乙婦的聚合物）高速密封离心管和vTi 50转子的超速离心机，氯化铯法提纯包含目的基因的病毒载体后，再用碱裂解法纯化。 3. 转染之前的24h ，接种IXlO6 293GP细胞于IOml完全DMEM/10% FBS的 IOOmm 细胞培养皿中。孵育。 4. 转染当天，在灭菌的6m l的聚丙烯管里混合20哗氯化铯纯化的病毒载体D N A和 2(V g p C M V -G ，它包含C M V I E 启动子控制的V S V -G 基因。用 T E 79/10调整体积到437卩1。 5. 加 63W 2 3mol/L CaCl2并混匀，然后加5(%1 2X He B S 并持续搅

6.室温静置30m in使形成磷酸钙七 +m、 5〇 % 汇合■ ■ 养显（ 70% ^ 物。把沉^ _ A 2 9 3 G P _ 至少达到的），孵育 8 h 。 S〇 /q 是理想的，细胞密度对病毒制备是至关紧要 7. 以 6tnl新鲜的 D M E M / i O % F B S 换液 8 . 在转染后的24〜96h，收集培养基卜并于一7〇T：储存。上凊液，使用灭囷的〇. 注射式过滤器过滤，因为 V S V -G 的过量表达，在姑逃 ^ 对脱 I 絲在细航亡变大量， ^ 并从细胞培养 a a u 、主、、此、 undefined u ^土a 你士 1 、之目’ 在转k 后 24： h ，可月匕收获而滴度的病毒，上^ 能， ^ 收” 到軸在皿上的转染细胞 < 3 Q % 。为了要更进一步丙增母加 ^ 和细胞换液期间不扰乱那些黏附不好的母间隔处收集一次，达到 293G p 细胞。转 - 天 3 次。然而重要的是在病毒大量的细胞损失。对于假包膜反转录病毒载体的小量（〈 i 00mi) 收集 9a. 在 W C 薩冻存的病毒，冑移到如 ^ 的麵誠层流通风橱紫外线灭菌过細 Beckman超净离心管里。以 50 〇〇〇g ，代离心 9〇min。 l〇 a•在层流通风橱弃去细胞上清液。用〇.5% 〜 1 % 最初体积的DMEM/1〇 % F B S 或 0. I X H B S S 重悬病毒颗粒， 4°C 。温和的用吸移管分散病毒聚集物。孵育过夜。 lla. 分装病毒L 一 70°C保存（通常有传染性的病毒<5〇%复苏的）。为进一步提高病毒滴度，进行第二个超速离心步骤（已经被证实滴度可高达109c:fu/ml)。对于假包艇反转录病毒载体的大量收集 9b. 在 37° C 融解冻存的病毒，转移到灭菌的 250m i 宽嘴离心瓶。 4〇c ， 13 〇〇〇g_ (9000r/min用 G S A 转子）离心 15h 以沉淀病毒。 10b. 4°C 重悬病毒颗粒。温和的用吸移管分散病毒聚集物。孵育 4h。 llb. 分装病毒，一7〇°C 保存（通常有传染性的病毒是复苏的2 0 % 〜4 0 % ) 。 1 2 . 转染前 2 4 h , 每 I O O m m 细胞培养皿2 X I O 5 的密度接种鼠N I H 3 T 3 细胞在D M E M / 10% F B S 中。 13. 0 •1、 1 和 IOjbJ 收获的病毒传染细胞在含“ g/m l 聚凝胺培养基中。孵育过夜。 14. 换新鲜的D M E M /10% F B S 培养基并加80(V g / m l 的 G 418。每 3d 重复1 次。 15.感染后两个星期， 1〇〇%甲醇固定G 418抗性克隆lOmin， 0 . 0 4 % 吉姆萨染色液染色 lOmin，计数。用 G 418抗性克隆的数目乘以对应稀释倍数确定未稀释病毒原种的滴度，表示成cfu/m l。备选方案来自稳定包装细胞的假包膜反转录病毒的制备这个方案对假包膜反转录病毒载体的大量制备是有用的。附加材料（基本方案；标V 的条目参见附录1) 双向性包装细胞株PA317的培养物包含目的基因和neo 基因的反转录病毒载体 V 80m g/m l潮霉素

lmg/m l 曝呤霉素 ^/lmg/m l 四环素 N^ OOjamol/L 的 P 雌二醇 6 孔和 24孔细胞培养板 1. 转染前24h ，按每100m m 细胞培养皿l X 106的密度接种P A 317 细胞在D M E M /10% F B S 中。孵育。 2. 转染细胞用20Mg 包含目的基因和„eo选择基因的反转录病毒D N A (基本的方案，第 4〜7 步)。 3. 转染后48h ，收获病毒， 0.45jum注射式过滤器过滤，并于一70°C: 保存。从 P A 3 1 7 细胞短暂转染产生的病毒载体滴度取决于反转录病毒的结构， Io2〜 103cfu/ml〇 4. 反转录病毒感染前24h ，按每 I O O m m 细胞培养皿2 XIO5的密度接种293G P /G~21细胞在D M E M / 10%F B S 中，力 n 800m g /m l 的潮霉素， lmg/m l 的嘌呤霉素和2mg/ml 的四环素。 5. 用第 3 步收获的双向性病毒传染第4 步描述的293G P / 0 2 1 细胞，加 4m g /m l 聚凝胺在培养基中。感染后24h ，用第 4 步描述的培养基加800mg/ml G 418给细胞换液。 6•每3d 用第 4 步描述的培养基加800mg/ml G 418给细胞换液。 7. 筛选两周后，用自动移液器挑GA18抗性克隆接种接到2 4 孔细胞培养板，然后从24 孔接种到6 孔细胞培养板，再然后是I O O m m 细胞培养皿如果需要的话。 8 . 为了识别高滴度的病毒产生克隆，诱导病毒产生前24h ，按每 I O O m m 细胞培养皿 2X 106 的密度接种这些细胞在D M E M / 1 0 %F B S 中，加 800m g /m l 的潮霉素， Img/ m l 的嘌吟霉素， 800mg/ml G 418和 2m g /m l 的四环素。 9. 诱导的当天，用 10m l D M E M /10% F B S 换液。为了要除去残余的四环素， 37°C 至少孵育细胞30min并再一次用新鲜的D M E M /10% F B S 换液。重复这一步骤三次。 10. 为了要诱导病毒产生，把 2mmol/L 的浓度卩-雌二醇加入10ml D M E M /10% FBS。 11. 加卩-雌二醇后72h ，收获病毒培养物上清， 0.45p m 注射式过滤器过滤。确定 N I H 3T 3细胞病毒滴度（基本方案，第 12〜1 5 步）。 12. —旦高滴度生产克隆被分离，接种，洗并诱导如第8〜1〇步所描述的，生产细胞将大量产生病毒。卩-雌脂二醇诱导后48h ，可以一天三次收集病毒培养物上清液，持续达两周并可超速离心收集的培养基以进一步浓缩病毒（基本方案，第如〜Ila或 9b〜Ilb 步）。

来源：丁香实验

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