基本方案3 杂交和数据提取

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	玻璃芯片
试剂、试剂盒	50 X Denhardt 溶液 20 X SSC 酵母 tRNA 0.06X SSC 洗脱缓冲液 10% SDS
仪器、耗材	水浴锅热循环仪薄壁 PCR 管图像分析软件芯片杂交板临床离心机芯片扫描仪

步骤

$1. 估计需要的杂交液的体积（很关键）。一般来说，按每平方毫米盖玻片面积0.0334 的量覆盖芯片（如 24m m X 50m m 玻片用40juJ)。 2.对一 40jul的杂交体系，将 C y 3-和 C y 5-标记的 c D N A 加入一个〇.2 m l 薄壁 P C R 管，加入 D E P C 处理水或者使用加速蒸发器去除水以调整至30M 1体积；不要使用高热或热照明。 3. 混合下面的物质：对于 high sample blocking 对于 high array blocking C y 5 + C y 3 探针 30^1 28^1 8m g / m l poly (d A ) IjLtl 2jLtl 4m g / m l 酵母 t R N A M 2jA 10m g / m l Cot-1 D N A ljul 0[il 20 X S S C 6|ul 6^1 50 X Denhardt 溶液 IpJ (可选） 2{A 当芯片上对照重复的 D N A 样本的剩余杂交时，用 high sample blocking配比。当在所有的芯片组件上有弥散背景或烟雾时，用 high array blocking配比。作者一般先用 high sample blocking 配比。 4.将混合物完全混匀，热循环仪上98。 (：加热 2min ， 25°C 快速冷却，加入 S D S 。 16 OOOg•离心5min。将覆盖有杂交混合液的24m m X 50m m 盖玻片与倒转的芯片接触，小心避免气泡产生。在操作实际样品前先用缓冲液和平整的载玻片练习。 5•将载玻片置于气密的芯片杂交板，加人 5^1 3X S S C 于蓄水池（如果杂交板有提供）或载玻片末端的刻线上，封闭杂交板。将此杂交板浸人65° C 水浴，杂交 16〜21h。 6. 从水浴中拿出杂交板，冷却，小心干燥。打开杂交板，移掉载玻片。 7. 将仍然黏附有盖玻片的载玻片置于盛有〇.5XSSC//〇.〇1% S D S 洗脱缓冲液的c〇plin 缸中。让盖玻片从载玻片上脱落，然后用镊子将盖玻片从◦ 叩丨以缸中取走。冲洗载玻片 2〜5min。将载玻片转入新的盛有〇.〇6X S S C 洗脱缓冲液的c 〇 pUn缸中。冲洗载玻片2〜5min。对更严格的冲洗，加入一个先用〇.5 X S S C / 〇〇1% 8 1 ) 8 的冲洗步骤或者重复正常的冲洗方法两次。 8. 转移载玻片至一载物片架上，在装有卧式转子微量滴定板的临床离心机上16^_低速迅速离心3min。不要在空气中干燥。$

9. 将载玻片放人芯片扫描仪内，调节光电倍增管电压和镭射能量以使最亮的信号生成稍微少于最大可能的读数（如 65 535对于16b k 标准）且背景值（阵列点间）在零以下大体一致。收集整个图像的数据。 10. 将收集的图像输入图像分析软件检测整个杂交的质量，注意不一致处和背景层次，信号的层次和分布，每一信号通道的相关强度和大部分基因信号的相似性。支持方案I E S T 的琼脂糖凝胶电泳材料（标V 的条目参见附录1) I X T A E 缓冲液配制的2 % (m A O 琼脂糖凝胶（附录 3G ) V 50 X T A E 缓冲液 V E S T 上样缓冲液 96孔板的P C R 产物（基本方案1，第 2 0 和 27步） V IOObp长度的标准品电泳参数米用容量为4 个 50孔的梳齿（如 Owl Scientific) 一次性的微量混勻盘（如 Becton Dickinson) 可编程的、 12通道的移液器和一次性吸头（如 Matris Technologies) 1.将 I X T A E 缓冲液配制的有4 个 50孔梳齿的2 % (m " ) 琼脂糖凝胶，浸入盛有足够覆盖凝胶表面的I X T A E 缓冲液的电泳槽（附录 3G )。 2. 准备盛上样缓冲液的容器，使用 12个一次性的微量混匀盘。 3. 调节 12道的移液器以便执行下面的步骤：装 2jul; 装装 2jul; 混合体积 5 次；除去 5|ul。 4•按96孔板 A l 至 A 1 2 的顺序点V P C R 产物。点 1^1空气。点 2 4 的上样缓冲液。 5. 将吸头置于一次性的微量混匀盘的干净加样孔，用移液器混匀样品和上样缓冲液。 6. 将移液器置于一个50 孔的排以使吸头含有从孔A l 来的 P C R 产物加入第二排的孔中，接下来的每一个孔也照此步骤。 7. 重复此过程（每一次换吸头），从 P C R 板的 B 排第三个孔开始，与 A 排交叉， c 排从 26孔开始， D 排从第27 孔开始，与 C 排交叉。于孔1〜50各加入5jul的 IOObp大小的标准品。 8•重复此过程，上样以排E 、 F 、 G 和 H 的顺序于第二个50孔的梳齿的凝胶中。上样按两个96孔 P C R 板一块胶，或者 16个 P C R 板的单排样品。为了减少扩散和混合，每上完一批样提供I m i n的电压。 9.提供电压开始电泳，让凝胶跑至溴酚蓝（快的条带）接近下一部分胶的胶孔的边缘。给凝胶拍照以便将来参考。看条带以完全一致的亮度分布在600〜2000b p 大小的范围内。将来对这些图像的计算机分析能够提供条带数目和大小的详细情况

$支持方案2 荧光光度法测定D N A 浓度材料（标V 的条目参见附录D V F l u o r 缓冲液 96孔板的P C R 产物 • V T E 缓冲液， p H 8 ■ \ / 5 0 j u g / m l 、 lOOjug/m l、 250jug/ml 和 5〇 Ojug/ml 的单链 D N A 标准品用于荧光检测的96孔板（如 Dynex) 12通道的多用移液器突光计（如 P E Biosystems) 装有 Microsoft Excel Software的计算机，因为荣光计没有自动分析功目旨 1. 标记一 9 6孔板用于荧光检测。用一 12通道的多用移液器加20〇4的Fluor缓冲液于每一个孔。每个孔中的P C R 产物取IjlJ 从 P C R 孔板的一排加至荧光板的一排；按荧光板 A 至 G 排的顺序。 2. 在荧光板的最后一排，加的 T E 缓冲液于第一和第七个孔，加 IjuJ的系列单链 D N A 标准品（ 50jug/ml、 100/Ltg/ml、 250jbtg/ml 和 500jug/m l)于剩下的孔中。 3. 准备一个拥有346n m 激发光和460n m 发射光的荧光计。必要时调整空白。如果荧光计不能支持自动分析，以 Excel表格形式输出数据。 4 . 以 0〜50(V g /m l d s D N A 检测标准化反应的线性度和产量。从样本和对照中减去空白值。以下列公式计算P C R 反应中d s D N A 的浓度： d s D N A (jug/ml) = P C R 样本值/平均 lOjutg/ml 值X 100。支持方案3 用多聚赖氨酸包被玻片第 1 1 章转录谱 •513 • 材料（见附录1) V 清洗液 V 左旋多聚赖氨酸溶液金牌显微镜玻片（ Becton-Dickenson ) 50slide不镑钢架子和50slide玻璃槽（ Wheaton) 25Slide 塑料架和 25slide 塑料盒（Shandon Lipshaw) 不带纸或软木塞的塑料玻片盒（如 P G C Sientific) 注意：当处理玻片时戴好无粉末的手套。如果接触到皮肤或是油脂的表面，要及时更换手套。用玻片清洗剂清理玻璃器皿和架子，该过程中必须使用超纯水。不能使用去垢剂。 1 . 把金牌显微镜玻片插人50槽玻片架上，然后将架子放入盛有500m l 清洗液的玻璃槽中。再将此槽置于平板摇床上以60r/min 的速度振荡2h 。 2 . 将清洗液倒出，然后在水下冲洗玻片3m m 。重复 4 次。 3 . 将玻片转人25槽塑料玻片架中，将其放入小的塑料盒中。将每个盒子中的玻片没人 200m l 左旋多聚赖氨酸溶液中，再于 60r/min振荡 lh。$
4 . 用水冲洗玻片3 次，将其置于水中Imin。 5 . 在 400g 离心2min，干燥玻片盒以备存放。 6 . 满1 玻片放回玻片盒中存放，并在其移置塑料玻片盒前直立过夜（不要用纸或软木塞）。于印迹前于室温下存放2 周。

4 . 用水冲洗玻片3 次，将其置于水中Imin。 5 . 在 400g 离心2min，干燥玻片盒以备存放。 6 . 满1 玻片放回玻片盒中存放，并在其移置塑料玻片盒前直立过夜（不要用纸或软木塞）。于印迹前于室温下存放2 周。

来源：丁香实验

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