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    基本方案 对来源于实体肿瘤、淋巴瘤的分裂中期的细胞进行细胞遗传学分析

    相关实验：实体瘤培养分裂中期细胞的收获和细胞遗传学分析实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    试剂、试剂盒
    1 X 胰蛋白酶 EDTAKCl秋水仙酰胺甲醇 冰乙酸
    仪器、耗材
    离心管倒置显微镜玻片加热器

    步骤

    1 . 向生长状态良好的肿瘤细胞培养物中加入10^1 lO yg/m l的 秋 水 仙 酰 胺 （ 终浓度 O.OSjug/ml)。对 于 生 长 缓 慢 的 培 养 物 则 要 使 终 浓 度 达 到 0.04〜 O.OSjag/ml。静 置15〜18h 。 2a•对于单层（ 贴壁生长）的细胞：当细胞生长至汇合度达80%左右时将培养基转移到 15ml离心管。向培养瓶加入2m l胰蛋白酶/E D T A ，短暂摇匀移入离心管。再向培 养瓶中加人新鲜的胰蛋白酶/E D T A 静 置 5min。倒置显微镜下观察细胞。剧烈拍击 瓶壁以使所有的贴壁细胞脱离瓶壁。如果仍有贴壁的细胞则再静置5〜10min。将所 得细胞悬液移入离心管。 2b. 对于悬浮生长的细胞： I d 内将培养的细胞及培养基一同转移到15m l 离心管。 3 . 室温下300g 离 心 lOmin，弃上清，拍打管壁使细胞沉淀分散。以 7ml 0.067m d / L K C l 重悬细胞并静置2min。向管中加入7 滴固定液，颠倒混匀数次。 300g 离心 lOmin，弃上清。拍打使沉淀松散，以 7m l 固定液重悬，静置于一20° C > l h (不超 过 4 周）（ 对于用奎纳克林染色的中期细胞则选择冷凝；单 元 4. 3)。 4. 300g 离 心 IOmm，弃上清，以 7m l新鲜固定液重悬。再次离心并以数滴新鲜固定液 重悬。制备分散染色体标本（ 单 元 4.1)，根据具体情况调节温度和湿度。如果染色 体分散不良并且聚集在胞浆中则将低渗步骤改为静置于0 •067mol/L K C l 中 lOmin。 将玻片置于60°C 玻片加热器上> 2 4 h 或 70〜75°C 加热器上lh。 5 . 以 G T G 显带技术染色（ 单 元 4. 3)。如果用的是70〜75°C 玻片加热器则缩短胰蛋白 酶处理时间5 0 % 。 6. 分析从造形术人口和至少一二倍体分裂中期的10 或更多分裂中期建立固定的分型。 如果标本中中期细胞很少则用2〜3 倍的秋水仙酰胺（ 终浓度〇.〇4〜〇.OS1 UgAnl) 处 理过夜重新收获中期细胞。 支持方案1 将实体肿瘤的细胞分散并培养 附 加 材 料 （ 基本方案；标V 的条目参考附录1) 肿瘤标本（ 任一种实体癌肿、肉瘤、生殖细胞或神经瘤） V 肿瘤运输溶液（ 室温） 7 加人了 15% F B S (体积比）的 R P M I 完全培养基补加两性霉素至2. 5|ug/ml (该培 养基4° C 保存不超过1 个月） ，培养基预热到37°C V 10 m g /m l 胶原酶 灭菌手术刀片 25cm2 组织培养瓶 1.将手术取出的肿瘤标本立刻放入肿瘤运输溶液中，尽可能快地送到实验室。如果不 能立即进行分散则将肿瘤标本放在肿瘤运输溶液中于4°C 保存不超过12h 。
    2. 用手术刀片将标本切割成小于I m m 3 的小块。加 人 5〜IOml预热的含lm g/m l胶原 酶的加入了抗生素的RPMI/FBS完全培养基，静置过夜。 3. 反复吹打肿瘤胶原酶混合物以分散细胞团，接着以300g 离 心 l〇 m in。弃上清，用不 含胶原酶的加入了抗生素的培养基重悬沉淀。 4. 取 2m l 悬液接种到25cm2 组织培养瓶，在倒置显微镜下观察。调整接种的细胞悬液 的量使得单细胞和细胞团能占据培养瓶底面的2 5 % 〜5 0 % 。将剩下的细胞悬液分别 接种到另外的培养瓶中，如果可能接种至少3 个培养瓶。补加不含胶原酶的加人了 抗生素的培养基使得终体积达到5ml。静置培养。 增强型的R P M I / 1 5 % F B S 培养基能够促进约2 5 % 实体肿瘤短期生长，它含有 0.25% (体积比）抑 肽 酶 （ S i g m a), 1 % (体积比）牛垂体后叶素提取物（ Collaborative BiomedicaD 和 0.5% (体积比）M i t o + 血清 （Collaborative Biomedical)。 这 种增强型培养基不能用于分散细胞（ 第 2〜3 步） 。 5. 每日用相差显微镜观察培养物中哪种类型的细胞增殖。当培养基开始变黄时要及时 更换。如果发现培养的细胞是成纤维细胞则终止培养。当培养的肿瘤细胞生长活跃 并覆盖到培养瓶面积的80% (—般 在 4d 内） ，按照前述方法（ 基本方案）收集细胞 中期分裂相。 支持方案2 培养淋巴结（ 淋巴瘤）标本用于细胞遗传学分析 这种细胞遗传学方法适用于所有淋巴系肿瘤，包括霍其金氏病和非霍其金氏病。 附加 材 料 （ 基本方案；标V 的条目参见附录1) 淋巴结标本 V 肿瘤转移溶液，预冷 V 加入了 2.5/Ltg/m l 两性霉素的完全R P M I /15% (W V ) F B S 培 养 基 （4。 (3保存不超过 1 个月） ，预热至37°C V l〇 m g /m l 胶原酶 聚 蔗 糖 （ Sigma) VHBSS 0. 075mol/L KCl 25cm2 组织培养瓶或60m m 圆形培养皿 1. 将手术取出的淋巴结标本放人预冷的肿瘤转移溶液，置于4°C 1〜6h。 2. 将淋巴结标本分割成小于I m m 3 的小块，加 入 5m l 预热的加入了 lmg/m l 胶原酶的 完全 R P M I /15% 0//V ) FBS 培养基。静置 30min。 3. 小心地将上述瘤组织悬液转移到15m l 离心管中，铺 在 5m l 聚蔗糖上。 700g 离心 20min。用灭菌过的移液器头小心地将聚蔗糖/胶原酶界面层（ 一层白不透明的单核 细胞）吸出，允许吸出1〜2m l 周围的聚蔗糖和胶原酶。 4 . 向单核细胞中加人1〇11111^83， 300发离心1〇111丨11。去上清，用51111不加胶原蛋白酶 (collagenase) 的 完全R P M I /15% ( V A O F B S 培养基重悬单核细胞沉淀，转移到 25cm2 组织培养瓶或60m m 圆形培养皿，加人至终浓度为〇.Ol^g/ml。培养过夜。
    5•按照前述方法（ 基本方案，第 2b 步）收集细胞中期分裂相，将其步骤中K C l 浓度改 为 0. 075mol/L。 支持方案3 制备渗出物（ 体液）标本用于细胞遗传学分析 附加材料（ 基本方案；标^/的条目参见附录1) 恶性渗出物标本 10jug/ml 长 春 碱 （ Lilly) l O m g /m l 溴化乙锭，于暗色或锡箔纸包裹的瓶中4°C 储存 V 加入了 2.5^g /m l 两性霉素的完全R P M I /15% (V /V ) F B S 培 养 基 （4°C 保存不超过 1 个月） ，预热至37°C 0.85% (m /V ) 氯化铵，仅对于血液样本 50m l 离心管 25c m 2 组织培养瓶 1•迅速将取出的体液标本在其自然冷却到室温前转移到实验室。将 30m l体液标本加入 到 50m l离心管中并向其中加入150^1 10/xg/ml的长春碱和304 lO m g/m l的溴化乙 锭。静置 l h ，按照前述方法（ 基本方案，第 2b 步）收集细胞中期分裂相。如果可能 则同步多管收集。 2 . 如果可能则在直接收集中期分裂相的同时（ 收集工作进展到上述将恶性体液标本加 入 到 50m l 离心管中静置）建立同步多瓶培养。 300g■离心15m i n ，去上清液。 3. 如果细胞沉淀有血色，则 用 IOml 0.85%氯化铵重悬，将悬液转移到15m l 离心管。 室温静置15m i n ， 300g 离 心 I O m i n ，去上清液。细胞沉淀不呈血色的则省略这一步。 4 . 每一管细胞沉淀用5m l 预热的加人了 2. SjU g A n l 两性霉素的完全R P M I /15% (W V ) F B S 培养基重悬，加人到25c m 2培养瓶里。用倒置显微镜观察细胞。其余管沉淀则 重悬到其他培养瓶中，做到每一个培养瓶中加入的细胞数不同，并且当细胞贴壁后 达 到 3 0 % 〜7 5 % 的汇合度。静置培养，当培养基开始变黄时更换培养基。 5 . 当培养的肿瘤细胞生长活跃并覆盖到培养瓶面积的80% (—般 在 2〜5d 后） ，按照 前 述 方 法 （ 基本方案）收集细胞中期分裂相。

    来源：丁香实验

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