最新修订时间：2024-05-13
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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APOE-Based Models of Pre-Dementia
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![A PO E引物： 前向引物:5'-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3' 反向引物:5'-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC-3' V^Ommol/L 4dNTP 混合物(Roche;每 dNTP 浓度为 10mmol/L) 5U/jul Tag 酶 (Roche) 二甲基亚砜（ 出11161； ]1713111£〇 又丨 €16， 〇]\48〇) 含 15mmol/L MgCl2的 IOXPCR 缓冲液(Roche) E x o - S A P - I T ( U S B ) 扩 增 SN P 的寡核苷酸引物(延伸反应） ： 5，-GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'(APOE112) 5，-CGG CCT GGT ACA CTG CCA G G C ^(A PO E158) AcycloPrime-FP SNP 检测试剂盒(Perkin-Elmer Life Science)包 括 ： IOX缓冲液 AcycloTerminator 混合物 AcycloPol DNA 聚合酶 96 孔板（ MJ Research) 96孔 板 PCR仪 80°C水浴箱 96孔板突光偏振检测设备(如 Perkin-Elmer Life Science公 司 V ictor系列） L 在 96孔板中准备PCR扩增体系（ 30^1体系） ： gDNA(用 3〜^ng/jul gDNA) 30〜50ng; APOE前 向 引 物 6pmol; APOE反 向 引 物 6pmol; 各 dNTP 0. 5nmol; T叫 酶 I. 25U; DMSO 至终浓度 10% (V /Y ); 含 I. 5mmol/L MgCl2的 I XPCR 缓冲液。 3 4 5 2. PCR参 数 ： 起始步骤： IOmin 94°C(变性) 32个循环： 30s 94°C (变性) 30s 56°C (退火) Imin 72°C (延伸) 最终步骤： 7 min 72°C (延伸) 3 .每孔转移5W PCR产物至一新的PCR板 中 ，加 Exo-SAP-IT，37°C孵 育 lh 。 4. 80°C孵育 15min 使 Exo-SAP-IT 失活。 5 . 在一 96孔板中设置两个APOE SN P位点的延伸反应(20jul体系） ： 244bp PCR 产物(第 4 步）7 4 ; 扩 增 S N P 的寡核苷酸引物(APOE112或 APOE158) 50pmol; IOX缓 冲 液 24;](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470124809589vxzfaur7cypng_small.jpg)
![AcycloTerminator 混合物 Ijul; AcycloPol DNA 聚合酶 〇.〇5jLil。 6. PCR参数： 起始步骤 ： 2min 95°C (变性） X 个循环： 15s 95°C (变性） 30s 55°C (退火） 最终步骤 ： 2min 15°C (冷却） X=APOE112为 3 0 个 循 环 ，APOE158为 6 0 个 循 环 。 7. 4°C 150g 离心。 8. 96孔板突光偏振检测设备上检测。 备选方案3 S N a P sh o t分析法检测A P O E 基因型 SNaPshot分析法所用的引物不同于基本方案所用的引物，因为该方案来自不同的实 验室。 材料(标V 的条目参见附录1) 溶解于T E 缓冲液(pH7. 4,附录1)的 3〜Sng/jul gDNA(来自血液） APOE引物： 前向引物^-CCA AGG AGC TGC AGG CGG CGC A-3' 反向引物:5^GCC CCG GCC TGG TAG ACT GCC A-3' 100mmol/L 4dNTP 混合物(Roche;每 dNTP 浓度为 25mmol/L) 5U/pl Taq 酶(Roche) 二甲基亚砜(DMSO) 含 15mmol/L MgCU9 IOXPCR缓冲液(Roche) QiaQuick DNA 纯化试剂盒(Qiagen) 测序引物： 5’-CGG ACA TGG AGG ACG TG^ ( APOE112) 5’-TTT TTT TTT TCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'(APOE158) SNaPshot 混合物(包括突光标记[F]ddNTP;Applied Biosystems) 牛小肠喊性憐酸酶(Calf intestinal phosphatase， CIP; New England Biolabs) DNA ladder(GeneScan-120LIZ,Applied Biosystems) Hi-Di 甲醜胺（ Applied Biosystems) 96 孔板或 384 孔板（ MJ Research) 75°C水浴箱 ABI PRISM 3100 测序仪（ Applied Biosystems) GeneMapper 2.0 或 GeneScan 软件（ Applied Biosystems) I .在 96孔板或384孔板中准备PCR扩增体系(25jul体系） ： g D N A (用 3〜5ng/jul gDNA) 30〜450ng; APOE前向引物4pmol;](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470124824336b3tuawbnx2png_small.jpg)
![APOE反向引物I .4pmol; 各 dNTP 5nmol; T a q 酶 0. 5U ; DMSO至终浓度10%(VA〇; 含 I .5mmol/L MgCl2的 I XPCR 缓冲液。 2. PCR参数。 起始步骤： IOmin 94°C (变性) 35个循环 30s 94°C (变性) 30s 60°C (退火) 30s 72°C (延伸) 最终步骤： IOmin 72°C (延伸) 3. 用 QiaQuick D N A 纯化试剂盒去除多余的d N T P 和引物。 4. 在 96孔板或384孔板中准备测序扩增体系（ IOjlJ 体系） ： 217bp P C R 产物(第 3 步）Ijul; 测序引物(A P O E 112或 A P O E 158) 2p m 〇 l; 10 X 缓冲液2^1; SNaPshot 混合物 5 4 。 5. 扩增参数： 25个循环: IOs 96°C (变性） 5s 50°C (退火） 30s 60°C (延伸） 6. 为减少未结合[F ] d d N T P 的干扰，扩增产物中加2. 5jul C I P ，于 37°C孵 育 lh。 7. 75°C水 浴 15min使 CIP失活。 8. 加入D N A Ladder和 HI-DI甲酰胺于SNaPshot产物中，并 于 ABI PR I S M 3100测序 仪上扫描。 9. 用 GeneMapper 2. 0 或 GeneScan软件鉴定和确认A P O E 的基因型。 96孔板荧光偏振检测设备上检测。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470124837522bxu8ewb2t4png_small.jpg)
