F V 载体的生成和造血干细胞的转导

相关实验：泡沫病毒载体的生成和对造血干细胞的转导

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

F V 载体的生成和造血干细胞的转导

材料

试剂

使用双蒸水和灭菌技术。

牛血清白蛋白（B S A ) 片段 V

CaCl2 (2.0m ol/L)

溶解 29.4 g CaCl2 于 IOOml H2O 中。过滤除菌。 4-C 储存。

细胞

293 细胞许多不同的亚克隆（ Graham e ta l.1 9 7 7 ) 都适用。选择一个已知的具有高转染效率的亚克隆。冻存多管以确保可重复性。转染前不要让细胞长过。一个冻存管可以复苏并在生长培养基中维持生长 4〜6 周用于转染。这之后，再复苏一个新管。

氯喹（100 mmol/L)

于 IOml 水中溶解 0.52 g 磷酸氯喹。过滤， 4°C 储存。

细胞因子（Xf 靶细胞有特异性）

干细胞因子（SCF)

Flt3-配体（FL)

血小板生成素（T P O )

DlO

DlO 即 DMEM 加 10% 热灭活的 FBS， 100 单位/m l 青霉素 G 和 IOOfigM l 链霉素。

二甲基亚砜（DMS 〇， 5% )

DM EM 培养基

胎牛血清（F B S ) , 热灭活（56°C ， 30m i n )

造血细胞

可以用已商业化的试剂和方法（MiltenyiBiotec, Auburn, California) , 采用磁珠将来自脊髓、夕卜周血或脐带血的人类 CD34+细胞分离出来。鼠的造血细胞可以从骨髓和 Miltenyi 体系缺陷系中获得。用 5-氟尿嘧啶（5FU) 对鼠进行预处理有利于干细胞的富集。此优化程序适用于非组织培养 6 孔板的造血再生细胞的转导。若用不同面积的平板或培养皿，则应相应的调整细胞密度和试剂体积。

2 X HEPES 盐

于 400 ml 水中溶解 8.18 g NaCl 和 5.96 g HEPES。用 0. 5mol/L NaOH 调整 pH 为 7.10, 用水调整终体积为 500 ml, 过滤。最终溶液为 280 mmol/L N aC l 和 50 mmol/L HEPES。 4°C储存。

人类纤连蛋白片段 C H -296 (RetroNectin， Takara S h u z o， O t s u ， Japan)

用无菌水溶解冻干的 RetroNectin 至 lmg/m l 浓度。 0.22 叫 1 滤膜过滤。一 20°C 保存。

磷酸缓冲液（P B S )，无钙镁离子

磷酸混合液
将 4.95 ml 1.0mol/L N a H 2P04 (于 IOOml 水溶解 12 g 单价盐）， 10.05 ml l. 〇 mol/LNa2 H P 04 (100m l 水中溶解 26.8 g 二代磷酸盐）和 85m l 水混合。过滤， 4-C 储存。

质粒 D N A

Aφ质粒载体（含有目的基因）

辅助质粒： P C i G S A ^ 、 p C i P S 、 p C i E S

质粒 D N A 可以用 QIAGEN 试剂盒或 CsCl 梯度离心纯化，用苯酚和氯仿萃取，乙醇沉淀后T E 中重悬（pH 8.0)。质粒可以在 68°C 下热处理 30m in 以消灭细菌防止污染。四个质粒F V 载体生成体系的细节详见图 1。

丁酸钠（500m m o l /L )

溶解 5. 5 g 丁酸钠于 100 ml D M E M 中。过滤，一 20°C 储存。