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基本方案2 羊水细胞间期核细胞分析实验

相关实验：羊水细胞用于间期核 FISH 分析的制备方法实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	附有羊水细胞的载玻片或盖玻片
试剂、试剂盒	2X SSC 乙醇生物素化的抗生物素蛋白抗体操作溶液苯二胺氟安定抗退色封固剂 PN 缓冲液杂交溶液 DAPI 染色液变性溶液荧光素标记的抗生物素蛋白生物素或地高辛标记 DNA 探针甲酰胺洗涤液二碘化丙锭
仪器、耗材	载物片加温器荧光落射显微镜和用来设置恰当荧光的滤光片胶布水浴箱玻璃盖玻片保湿室

步骤

1. 于 37° C 水浴箱，在盛有2X S S C 溶液的染色缸里，将附有羊水细胞的载玻片摇动l h 。 ^ 巍玻 2 . 在盛有 7 0 % 、冰水预冷的乙醇染色缸中漂洗玻片2rnin。每块玻片继续在 q/ 100%冷乙醇中脱水2m i n 。让玻片于室温空气中自然干燥。 ‘ 0和 3. 于 72°C 水浴箱，在盛有刚好70°C 变性溶液的染色缸中准确地摇动2 m i n (加—地后，就将水浴箱温度升高1°C )。这一步是成功的关键。 4. 重复第2 步。将变性后的玻片在载物片加温器中预热至37。〇，直至杂交。用于CT 卫星重复DNA探针 5a. 于 37°C 水浴箱，在 I.5m l 微量离心管中预热『卫星 D N A 探针液 5m i n 。又俗这一步所用的重复D N A 探针通过商业途径获得。在这一过程中为了特别要而进行一些探针的修饰提到了产物数据表。实验室关于不同的探针应用和探二标记方案参见单元4. 4 中的详细介绍。 6a. 每块玻片在杂交时，在一个新的微量离心管中混合L 预热的探针和3〇 ^预热杂交溶液。 ' 7^在一个7〇(3水浴箱中孵化探针/杂交溶液混合液5111丨 11，使探针变性。迅速在冰上冷却至 4°C 。稍微地旋动一下，然后以最大转速离心2〜3s。 8a. 用 3I .¥ 探针/杂交溶液混合液（1 5 n g D N A ) 使在第 4 步中制作的每块玻片上的染色体变性。用 24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住混合液，用较轻的压力将气泡赶走。用胶带密封。于保湿室37。 0 过夜（14〜18}1) 孵化（单元 4.4)。尽管这一过程称为过夜孵化，但在利用星重复 DNA 探针时，杂交的时间可缩至2〜4h。 9a. 于 43°C水浴箱中，在盛有 6 5% 甲酰胺洗涤液的染色缸内，断断续续洗涤玻片 15m i n〇进人第 10步。用于预先包装好的单一序列探针 5 b .取 IOm I 10〜100n g/M l包装探针至I.5m l 微量离心管内，用于与每块玻片杂交。

商业化的单一序列探针成套的预先与封闭的（ Cot-1) D N A 和 50% 甲醜胺杂交溶液进行了混合。许多商业化的单一序列探针（ Oncor) 不要求变性。 6b . 在一个37°C 水浴箱中，孵化包装探针5min。在这一过程中为了特别的需要而进行一些探针的修饰提到了产物数据表。实验室关于不同的探针应用和探针的标记方案见单元4. 4 中的详细介绍。 7b.用 IOfjJ 包装探针（10〇〜 iooong D N A ) 使第 4 步每块玻片上制作的染色体变性。 8b. 用 24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住混合液，用较轻的压力将气泡赶走。用胶带密封。于保湿室37°C 过夜（14〜18h ; 第 8a 步中的注释）孵化。 9b . 于 43°C 水浴箱中，在盛有 5 0 % 甲酰胺洗漆液的染色缸内，断断续续洗漆玻片 15m i n 。进人第1〇步。 10. 37°C 水浴，在盛有2X S S C 的染色缸内，间断地洗涤玻片8min。 11. 室温下在盛有P N 缓冲液的染色缸中简单地冲洗玻片。从染色缸中取出玻片，弄掉过多的液体但不要让玻片干掉。 12a. 生物素标记探针：用 60； j J 卵白素去杂交每块玻片上的染色体标本。放置一块 24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住溶液，用较轻的压力将气泡赶走。于 37〇c 保湿室孵化 20m i n 。 12b. 地咼羊标记探针：用 60juJ突光素结合羊抗地高辛F a b 片段去杂交每块玻片上的染色体标本。放置一块24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住溶液，用较轻的压力将气泡赶走。于 37°C 保湿室孵化20m i n 。 13.依次在三个独立的盛有P N 缓冲液的染缸中间断地洗涤玻片2m i n。 W a . 扩大生物素标记探针信号（如果需要）：用 604 51^1/)^的生物素化的抗生物素蛋白抗体去杂交每块玻片上的染色体标本。放置一块24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住溶液，用较轻的压力将气泡赶走。于 37°C 保湿室孵化20m i n 。重复第 13、 12a 和 13步。 M b . 扩大地高辛标记探针信号（如果需要）：用 60^15/^1/1111带有荧光素标记抗兔抗体的兔抗羊抗体，根据需要在步骤之间进行洗涤。一些情况下可以获得弱信号，可能需要进行第二轮信号扩大，这些片子需要重复第 1 4 步的操作。 15. 用 2 1 4 2；xg/m l的 D A P I 染色液和 2 14 2pg/m l的碘化丙锭去杂交每块玻片上的染色体标本。在暗室中室温孵化5min。 D A PI能提供最佳的细胞形态，而在中期分裂相碘化丙锭能提供一个一致的红色背景，从而便于观察黄-绿色荧光信号。 1 6 . 在一个盛有P N 缓冲液的染色缸中冲洗玻片3 m i n ，去除过剩的染液。 17•用21^x1苯二胺氟安定抗退色封固剂去杂交每块玻片上的染色体标本。用一个 2 4 m m X 60m m 的玻璃盖玻片盖住。 1 8 . 用荧光显微镜检查玻片，对能提供有意义结果的细胞照相。对每个所使用的探针每 5 0 个细胞计数杂交信号的数量，来分析中期核细胞。

来源：丁香实验

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