基本方案1 羊水细胞用于间期核 FISH 分析的非培养制备方法

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	PBS Triton X -100 固定剂乙醇低渗液丙酮
仪器、耗材	最小量必要培养基离心机螺旋管盖锥底离心管细胞离心机

步骤

1. 在一个15m 丨螺旋管盖锥底离心管中加1〜5m l 新鲜的羊水。 2. 轻轻地摇晃管子，使里面的细胞悬浮。加入 1〜2 倍体积不含血清的M E M ，洗涤细胞，然后室温下200g 离心 5min。 3. 小心地从离心机上拿出管子，不要碰碎了细胞团块。将上清吸出，留 I m l 管底的液体，然后使细胞块重新悬浮在剩余的液体中。 4•加人IOml低渗溶液。混勻，室温培养30min。 200g 离心5min，然后重复第3 步

用于拥有 Cytospin细胞离心机的实验室 5a•用足量的低渗液稀释样品，得到一个最佳的细胞浓度。如果使用单漏斗，稀释后的最终体积为〇 .5ml/片，如果用双漏斗则为 1〇 miz 片（弟 6a 步）。. 一般在姓娠巧〜1 7 周获取 2〜 3 m l 羊水可以制作 5 张玻片，每张 75〜 1〇〇个核型。这一步非常关键，但是必须通过反复试验来确定最佳的细胞浓度。如果细胞悬液太密，使细胞核和细胞质过分的折叠，减少杂交。悬液太稀导致玻片上的核型不足，分析起来更加麻烦。 6a. 用患者的实验室编号（如名字和登记号）标记载玻片，放在 C ytospin固定架上。将漏斗放在固定架上，固定。将固定架放在Cytospin上。 Cyto s p i n 单漏斗和双漏斗均可使用。使用双漏斗效率更高且成本低，可以将细胞置于同一载玻片的两个不同区域，这样在适当的时候可以使用不同的探针进行杂交。 7a. Cytospin配置固定架和载玻片后，缓慢、小心地将样品移转至漏斗上，将漏斗内的所有空气置换出来，以确保载玻片-漏斗的接触界面不再有气泡。 8a. 设置 C ytospin至 1500r/m i n 离心 4m i n 。仪器停止转动后，从固定架上取出载玻片，空气中干燥。进行第9 步操作。用于没有 C y t o s p i n 细胞离心机的实验室 5b . 滴人 I m l 室温保存的固定剂，沿着管壁缓慢滑入，轻轻地进行混合。加人 1〇 m i 室温保存的固定剂，沿着管壁缓慢滑入。盖上盖子，室温培养15m i n 。 6b . 室温， 200g■离心 l O m i n 。 7b . 小心地从离心机上拿出管子，不要碰碎了细胞团块。将上清吸出，留 im i 管底的液体，然后使细胞块重新悬浮在剩余的液体中。 8b . 重复第5b 〜7b 步两次，可省略 15m i n 固定剂中的培养。在小量（通常〇.5m l) 固定剂中悬浮细胞块，为制作载玻片获得一个理想的细胞浓度。每个样本准备1〜3 块染色体载玻片（单元 4. 1)。进行第9 步操作。 9. 在一个染色缸中将IOOjul 0. 2 5 % Triton X -I O O 和 40m l P B S 进行混合。室温下，将载玻片放在染色缸里摇晃5m i n 。 10. 将载玻片转移到预冷至一2〇°C 含 1 0 0 % 的乙醇的染色缸中，然后将缸子和载玻片在 —20°C 冰箱放置3〇 m i n (去固定玻片）（在 T r i t o n和乙醇处理之间没有必要冲洗或晾干玻片）。 11•在装有冰水预冷的丙酮染色缸中将玻片浸润几秒钟，然后在空气中干燥玻片（为使细胞膜透明）。立即用于F I S H 检测（基本方案2 和单元4. 4 ) 或在室温中储存至第二天（或在 4°C 或一20°C 中长期保存）。备选方案贴壁羊水细胞间期核F I S H 分析的制作因为有时候要用到盖玻片上的贴壁细胞，另外一些情况下要求初级培养，所以这个

$方案出报告的时间比基本方案1 更长一些。注意：在应用此方案进行后续的F I S H 分析时，最初可能要求细胞黏附在载玻片或者盖玻片上。为了简化，在此方案中只提及盖玻片。附加材料（基本方案1) 加有 1%〇 7\〇青霉素 /链霉素（10 00011/1111青霉素/10 000] ^/111丨链霉素； 81〇- Whittaker) 的原位杂交培养基（Irvine Scientific) 或 A m n i o m a x 完全培养基 (Life Technologies) 1.按照单元8. 2 的基本方案第1〜8 步准备用来培养的羊水，在放置培养皿/盖玻片时，使用配制好的原位杂交培养基或A m n i o m a x 完全培养基。 2•将带有盖玻片的组织培养皿放在培养箱中。静置培养24h ，使细胞牢固地黏附在盖玻片上。 3. 培养24h后，再轻轻地加1.5m l 相同的培养基（配制好的原位杂交培养基或Amniomax完全培养基），培养基在培养时就要准备好，继续培养。 4. 在继续培养24〜48h 后，小心地将皿从培养箱中取出。轻轻地将培养基倒掉，无需使用tip，再沿着皿壁加2m l 室温的低渗液。室温静置20min。 5. 在低渗液中沿着皿壁轻轻地一滴一滴地加2m l 室温的固定剂。室温静置5min，然后轻轻地将溶液抽吸出来。 6. 跟第5 步一样，轻轻地加2m l 新鲜的固定剂。室温静置5min，然后轻轻地将溶液抽吸出来。重复这一步操作两次或两次以上。 7. 在第一个培养皿中轻轻地加2m l 新鲜的固定剂，盖上盖。同样处理其他皿。 8. 根据单元8. 2 基本方案第19〜2 1 步，晾干盖玻片。立即用于F I S H 分析（单元 4. 4) 或者在室温中保存，直到第二天使用（可于 4°C 或一20°C 中保存更长）$

来源：丁香实验

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