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从石蜡包埋组织制备细胞核悬液用于荧光原位杂交 (FISH) 分析实验

相关实验：利用石蜡包埋组织鉴定染色体非整倍体

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	PBS 生物素洗脱液乙醇 2 X SSC 0.1 XSSC 溶于磷酸缓冲液中的去垢剂胃蛋白酶溶液二甲苯杂交液丙酮
仪器、耗材	孵育玻片的湿盒水浴箱单纤丝尼龙过滤网带刀片切片机锥底玻璃离心管玻璃盖玻片注射器染缸转筒形转头乳胶黏合剂恒温箱

步骤

1. 用切片机从待检石蜡包埋组织中切下1〜3 片厚50^111的切片（对于绝大部分类型的组织，两块IcmX Ic m 大的切片已含有足够数量的细胞核可用于最少I0 个探针的杂交了），置于15m l 锥底玻璃离心管中。 2. 加人5m l 二甲苯，放置5min，并不时用手晃动离心管。室温下200g 离心5min。吸去上清。 3. 用以下溶液重复第二步操作：二甲苯； 1 0 0 % 乙醇； 9 5 % 乙醇； 8 0 % 乙醇； 7 0 % 乙醇； 5 0 % 乙醇；去离子水（两遍）。该步骤操作成功的话，将不会再有质硬的白色斑点蜡状的石蜡残留于组织内。如果仅有极少量石蜡碎片残留，用适当工具将其剔出。如果难以剔出石蜡碎片，则标本需按照与以上洗涤顺序相反的顺序再次脱水（开始用水洗最后用二甲苯洗），然后重复去石蜡化及再水化。 4. 加入Iml胃蛋白酶溶液消化， 37〇 C 摇晃式水浴箱中水浴3〇min。 5. 用连接18G 针头的5m l 注射器将标本剧烈地上下抽吸吹打数次以打散细胞团块（一些细胞团块将始终存在）。 6. 用单纤丝尼龙过滤网过滤标本，将标本过滤至15111丨离心管中。 7. 于消化管中再加人4ml P B S 洗涤并过滤。将管中P B S 溶液倾倒于过滤网上过滤至第 6 步的离心管中，然后再往过滤网上倾倒4 m i ?6 3 洗涤滤网，仍将滤液置于同一个离心管内。弃去滤网。 8. 室温下200g•离心I0min。吸去上清。用 2ml p B s 重悬细胞沉淀。用连接21G针头的 5m l 注射器将标本剧烈地上下抽吸吹打数次。 9. 室温下200g 离心I0min。吸去上清。用巴氏吸管吸取p B S 重悬含独立分散细胞核的沉淀并滴片。两种不同探针可同时在一张玻片上进行杂交。如果需进行该操作，滴片时玻片两端都应滴上细胞核悬液（图 8.5.1) 。 10. 将玻片置于空气中干燥至少^ h。室温下敞开于空气中存放不能超过1 个月。若需长时间存放，则应于4°C 干燥箱中保存。

11.将玻片依次浸入含有下列溶液的50ml染缸中脱水，每个染缸内浸泡玻片2min，溶液均为室温： 2XSSC; 7 0 % 乙醇； 8 0 % 乙醇； 9 5 % 乙醇； 1 0 0 % 乙醇；丙酮。空气中干燥玻片。如需要可于室温下存放数夫。 12•在15^1杂交液中加人1〜1.25^1 (终浓度为lOng/^l) 生物素或地高辛标记的待检染色体的着丝粒探针（单元 4 . 4 ) ( 针对 2 2 m m X 2 2 m m 盖玻片）。 I 3•将探针混合液滴于玻片上，盖玻片覆盖于玻片上，排出气泡。在盖玻片边缘用乳胶黏合剂封片。如果在一张玻片上同时用两种探针杂交，则先加一种探针，封片（通常为 2 2 m m X 2 2 m m 盖玻片）后再加另一种探针以免两种探针混淆（图 8.5.u 。 14. 90°C恒温箱中孵育玻片5〜IOmin, 使探针和靶DNA变性。如果细胞核由于组织固定或保存中的某些未知原因而变得比较脆弱的话则应减 V 变性时间至 5min以内或降低变性温度至 75°C，以最低限度减少杂交信号的丢失或减弱。 15. 将杂交玻片置于湿盒中，于 37° C恒温箱中杂交过夜（12〜i 8h) ，使探针与靶DNA 充分杂交。 16. 在含有 39°C洗脱液的 50ml染缸中洗涤玻片两次，每次 15min (单元 “ )。洗涤玻片过程中需不断搅动玻片以充分洗涤干净。 17•将玻片置于含有39°C 的 0.1X SSC 的染缸中，于 39°C摇晃式水浴箱中水浴30min。 18. 将玻片转至含有室温PBD的染缸中，室温下放置 2min，并轻轻搅动玻片。玻片在 4°C下于 PBD中保存不得超过2 周，但该步骤中不可将玻片髯于空气中干燥。 19. 按照单元4. 4 的操作对染色体进行复染并检测探针信号。 20. 荧光显微镜下观察杂交玻片，记录每个细胞核中原始杂交信号的数量(荧光强度最

强的），忽略那些荧光信号强度较低的非特异性信号。备选方案从石蜡切片中制备细胞核悬液用于荧光原位杂交（ F IS H ) 分析附加材料（标V 的条目参见附录1) 1 0 % 、 2 0 % 或 30% W V ) 亚硫酸氢钠（ Sigma) 25mg/ml 蛋白酶 K (Sigma; —20°C 保存） V 硅烷化玻璃显微镜玻片 65°C 恒温箱 1. 用切片机从石蜡包埋组织中切下2〜IO^m 厚的切片，将切片置于硅烷化玻璃显微 ^ 玻片上，使切片漂浮于水中。 & 最佳的切片厚度取决于组织的全部细胞构成及胞间基质（如结缔组织），通常针对不同的组织类型应采取不同的切片厚度（某些情况下不同病例的样本亦应有不同处理）。理想情况下切片的厚度应尽量使细胞核的重叠程度最低以使每个细胞核都可以被检测到（细胞核平均直径为 5〜 15Mm ) 。除此之外，在较厚的切片中大量的细胞间基质将更加突出，这将在一定程度上使杂交信号变得模糊不清。 2. 空气中干燥玻片， 65°C 恒温烤箱烤片过夜使组织黏附于玻片上。 3. 组织切片的脱蜡处理. ：将玻片放入含有二甲苯的50m l 染缸中lOmin，然后放人含有 100%乙醇的染缸中洗涤两遍，每次5min。不时晃动玻片。空气中干燥玻片。若需亚硫酸氢钠处理，则按照第4 步操作，如果不需亚硫酸氢钠处理则直接按照第5 步进行蛋白酶K 处理。 4. 亚硫酸氢钠处理：将玻片放人含有10% 、 2 0 % 或 30% (m /V ) 亚硫酸氢钠溶液的染缸中， 43° C 水浴箱中水浴1〇〜30min。将玻片置于室温下含有下列溶液的染缸中，按照以下操作进行洗涤和脱水处理： 2 X S S C 两遍，每次Imin; 7 0 % 乙醇 2min; 8 0 % 乙醇 2min; 90%乙醇2111丨11; 100%乙醇 2min。空气中干燥玻片。亚硫酸氢納理论上可以通过增加酶与组织的接触而提高蛋白酶 K 的活性。那些 . 耐消化的组织需要更长的消化时间和高浓度的预处理液进行预处理。该处理的必要性还存在很大争议 --- 但如果杂交信号非常微弱则需进行该步处理。一 S•在4〇 m l 2 X S S C 中加入40〇 m 1的 25jug/m l 的蛋白酶K ，倒入染缸中，水浴中预热至 37。。。 6. 将玻片置入蛋白酶K /S S C 溶液中， 37。〇水浴箱中水浴1〇〜40min。 7. 室温下2X S S C 洗漆玻片3 遍，每次im i n。 8. 将玻片依次浸入下列室温下的溶液中进行脱水处理，每次2min:

70%乙醇； 8 0 % 乙醇； 9 5 % 乙醇； 1 0 0 % 乙醇；丙酮。 9.空气中干燥玻片，按照基本方案第12〜20 步操作进行杂交处理。

来源：丁香实验

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