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通过测序扫描识别杂合突变

相关实验：应用基于荧光的自动化测序进行杂合体检测实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	基因组DNA
试剂、试剂盒	寡核苷酸引物 10X PCR 扩增缓冲液线形丙烯酰胺 Ampli Tag Gold DNA 聚合酶上样缓冲液 TE 缓冲液 4dNTP 混合液 BigDye终止子循环序列反应试剂盒
仪器、耗材	热循环 PCR反应管 DNA 分析系统 PCR 纯化旋转柱

步骤

1. 设计扩增所需的寡核苷酸引物，选择的引物退火温度需要在57°C 左右，包含 18〜22 个碱基。定位引物以确保基因内侧翼序列至少6b p 长度和每个外显子一起扩增。用 B L A S T 搜索（单元6. 3 ) 每个引物以消除非编码的重复元件，比如Alu序列或长散在重复元件（ LINE)。 P C R 扩增和测序要使用同一个引物。必须根据P C R 扩增和外显子序列或其他感兴趣的基因组区域设计引物。尽管有许多电脑程序可以用来辅助设计引物， Wisconsin Package引物设计程序（Genetics Computer Group, littp://www. gcg. c o m ) 和 W I primer3 引物设计程序（ http:// w w w -genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3— w w w .cgi) 均是用户良好型的而且设计出的引物有很好的可信度。以上参数已被用于设计扩增一些大小在174〜421个碱基对的外显子引物。 2. 设置10(^1 P C R 反应管的扩增反应： 50〜500n g 基因组D N A ; ljumol/L 引物（用 lOpmol/L 的工作液）； 150jumol/L 10mmol/L 4dNTP 混合液； Ijul AmpliTag Gold D N A 聚合酶； IOjl J IOXPCR 扩增缓冲液，含 I.5mmol/L MgCl2。 3. 按以下扩增循环进行P C R 。起始步骤： 12min 95〇C (变性） 35个循环： 30s 94〇C (变性） 30s 57〇C (退火） 45s 72°C (延伸) 终止： 4min ， 720C (延伸）。 4•用P C R 纯化柱（如 Qiagen) 纯化P C R 产物（使用或不使用凝胶纯化法）。琼脂糖凝胶电泳（附录3G ) 和标准的已知浓缩物对比，估测纯化的扩增子的质量和浓度。或者在测序前测量〇〇26( )值（附录3D ) 以定量D N A 。 5•用双蒸水将ZSOjumol/L 的引物储存液稀释成2.5〜3.2； xmol/L 的工作液。根据厂家的 BigDye测序方案设定所感兴趣的扩增子的序列反应循环，并略做如下几处修改: 2. J^igDye终止子预备的反应混合液j 1〜I.3n g 纯化的扩增子作为模板（ > 2 0 n g 时，效果更好）；加双蒸水定容至7.4W 。 . 6•将反应管置于热循环仪并设置循环如下。

25个循环： IOs 96°C (变性） 5s 50°C (退火） 4min 60°C (延伸） 4°C储存样品纯化待用。 7. 为纯化测序的延伸产物，要进行两次乙醇沉淀（附录3B ) 或旋式柱纯化乙醇沉淀法中，用线形丙婦酰胺作载体使D N A 颗粒可见。干燥 D N A 颗粒^重寿；于^ 1.2〜2jul上样缓冲液中。 8. 将样品上于ABI377测序胶。包括对照在内进行双向测序。 9. 选择软件工具将A B I 层析图数据转换成数字信息进行分析，检测突变。由于 G A P 4 和 PolyPhred只能在 U n i x 平台运行，为了将在 Macintosh电脑上的序列信息输入转换到合适的 U n i x 主机上，文件转换工具如 F etch 是必需的。 Fetch 可以通过 e-mail申请（ Fetch@ dartmouth. edu) 免费获得用于非商业用途而像 Sequencher和 S w q M a n ， A B I 层析图文件可以直接在 Macintosh电脑上转换成类似的格式。因此， S e q M a n 和 Sequencher也可以在 P C / W i n d o w s 平台下运行。备选方案使用A B I3700 D N A 分析仪进行96孔板/384孔板的大量测序测序是确认常染色体显性遗传病和其他遗传病最敏感的一种方法。通常直接测序包( 含多个外显子的主要候选基因，通过这一方法对大量人群的D N A 进行扫描。材料（标V 的项目参见附录1) 10 X 丁 ag 缓冲液，没有 M g C V (Roche) V "25mmol/L MgCl2 V I .25mmol/L 4d N T P 混合物 Spniol/p l寡核苷酸扩增引物 Tag D N A 聚合酶 J p/^ 聚合酶（ Stratagene) T" t/i X L 3. 3X 缓冲液（Applied biosystems， Roche) 25m m o l/L 乙酸镁溶液 T U X L D N A 聚合酶（ Roche) 基因组D N A D N A 分子质量标记物、 I U / ^ 碱性磷酸酶（ U S B ) lOU/pl外切核酸酶I (U S B ) 稀释缓冲液（ Exo/ShrAP): 5 0 m m o l / L T r i s . C l ， p H 8. 0 5 X B i g D y e 稀释液（Milli-Q系列超纯水，过滤消毒； AppliedBiosystems) : 在 MiUi-Q 系列超纯水加入 400mmol/L Tris •Cl 和 10mmol/L M g C l 2 ， p H 9 BigDye 终止子序歹 (1 分析盒（Applied Biosystems) 96孔或 384孔 P C R 平台热控制/热循环

P E R F O R M A D T R 96 孔平极（Edge BioSystems) ABI 3700 D N A 自动化毛细管序列分析仪 1. 在冰上建立一个25/xlP C R 反应体系。用其中的一个反应体系。全部使用高保真性的 D N A 聚合酶混合物。 P C R 反应体系A : 2. 5|ul 10X T 叫缓冲液，没有MgCl2; 1.5jul25mmol/L MgCl2; 知1 I.25mmol/L 4dNTP (每个 dNTP 200pmol/L ); 2. 5jnl8pmol/jul 引物（最终 0 • 8/il); 0. 5〜0. 7U T 叫 D N A 聚合酶； '0.05〜0.07U P / w 聚合酶; 加 ddH20 至 25/^1。 P C R 反应体系B : 7. 5卩 1 T U X L 3. 3X 缓冲液； Ijul 25mmol/L 乙酸镁溶液；知1 I.25mmol/L 4dNTP (每个 dNTP EOOjumol/U ; 2. 5卩 1 8pmol/jnl 引物（最终 0 • 8|Ltl ); 0. 25〜0. 5pl T 认 X L D N A 聚合酶（ Roche); ddH20 至 254。最好的结果通常是完成200〜800b p 片段的扩增。根据外显子和内含子交界处的50〜100碱基的位置确定引物。寡核苷酸引物的大小通常是18〜25 个碱基。它有利于在变性时引物对温度<2。 (：。预计退火温度是在 Tm 值以下5 C ，但是也要根据实验进行调整。 2.移取23/zl的反应物到96孔或者384孔 P C R 平台并包括50〜IOOng的 2/J/孔基因组 D N A (总体积244/孔）。保持所有的试剂和样本都在冰上。 3. 简单离心。从冰上移取平台到热循环，预热到变性温度。用下列扩增循环执行P C R 。初步： 2.5min 95 °C (初步变性) 3 5 个循环 20s 95〇C (变性) 30s 退火温度 (引物特异性结合) Imin 72 0C (延伸) 1 个循环 5min 停止并保存于4°C。 72 0C (最终延伸) 4. 取 P C R 产物的小样本通过琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度。用恰当的£^八分子质量标记验证产物大小并估计浓度。假设每次序列反应每100b p 需要 10〜15ng的 P C R 产物，从平台转移2〜5“ 的 P C R 产物到新的％孔或者384孔 P C R 平台提纯和循环序列。 5 . 为了在P C R 的混合物中得到寡核苷酸和d N T P 准备下列的酶。准备过量反应所需要的标准混合物（准备240/J 在％孔反应中）。移取2jul酶到每个P C R 的反应体系中：

〇.IjlJ 1U /V 碱性磷酸酶；〇 • Ijul lOU/pd外切核酸酶I ; 1.8^稀释缓冲液。 6 . 简单的脉冲离心使残留液沿着管壁流下。替代P C R 管在热控制/热循环使用下列参数。 1 个循环 15min 37°C (酶孵化） 15min 80°C (酶热失活） 4°C (保存）暂时保存样本于4°C 或者冻存于一20°C 直到序列分析。 7•为了纯化P C R 产物，直接独立加循环序列试剂或者作为一个准备的混合物（在这点上 P C R 平台的无变化是必需的）。集合试剂和扩大反应的数量。每个体系反应： 4〜7/J酶纯化的P C R 产物; 1〜2|ul测序引物（4〜8pmol，推荐4pmol); 2julBigDye 终止子； 6pi IX BigDye 稀释液；加 ddH20 至 21/xl总体积。避免BigDye试剂的过度曝光，因为这样会导致荧光信号的减弱。选择成对的测序引物；每当 P C R 引物不能得到预期结果的时候就需要设计引物。当 P C R 产物非常长或者质量很差（如包括额外的条带）的时候成对的引物就体现出明显的优点。 8 . 轻度离心使物质沉淀，置于热循环仪中，并按照以下参数运行热循环仪。 25个循环： IOs 96°C (快速切换温度） 5s 50°C (快速切换温度） 4min 60°C (快速切换温度）快速切换温度至4°C ，待纯化。 9 . 纯化前，轻度离心平板，使物质沉降。根据生产商的使用说明，使用PERF〇 r m A D T R 96孔平板纯化循环测序产物。 1 0 . 在 80°C下干燥lh，并存储在一20°C 下，分析前应避光（可存放3 周）。在放入ABI 3700 D N A 毛细管测序仪前，应迅速用IOfJ 水重新悬浮。 1 1 . 获取A B I 层析图数据，并进行分析（基本方案，第 9 步）。

来源：丁香实验

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