材料与仪器
步骤
基 本 方 案 1 免 疫 印迹 法 检测 H IV 蛋白
本方案用蛋白质提取法定量测定细胞样品中病毒蛋白的含量。用 抗 H I V -血清及 125I标记的葡萄球菌蛋白 A 来进行检测。也 可 以 用 酶 联 二 抗（生 物 素 化 的 抗 人 I g G 抗体）和适当的颜色指示剂（亲和素-过氧化物酶耦合物及化学发光底物）进行检测以避免使用同位素。任 何 细 胞（包括培养的细胞系、培养的原代细胞及新鲜分离的外周血淋巴细胞）都可以用本方法进行检测。
材 料
待检测的细胞
P B S ，无菌
T E N C 裂解缓冲液，含或不含 2 % 脱氧胆酸钠
转膜缓冲液
l X T N 缓冲液， p H 7. 4
用 I X T N 缓冲液配制的 5 % 脱脂奶粉溶液， p H 7. 4
T N - T N 缓冲液， p H 7.4
抗 H I V 多克隆抗血清
T N - T 缓冲液， p H 7. 4
![用 T N - T 缓 冲 液 配 制 的 3 % 牛 血 清 白 蛋 白 （bovine serum albumin， B S A ) 溶 液 ， p H 7.4 O.lmCi/ml [125I] 蛋白 A (低 比 活 性 ； N E N )，用 3 % B S A /T N - T 溶 液 配 制 ， p H 7. 4 lOmmol/L E D T A ，用 T N - T N 缓冲液配制， p H 7.4 台式离心机及适当管子 玻璃器皿或可密封的袋子 平板摇床 1 . 计 数 细 胞 （附 录 3A ) ，将 5 X 106〜I X l O 8个细胞放入离心管中。室 温 ， 400g 离心 8〜lOmin，移去上清。将细胞重悬于5〜IOml无 菌 P B S 中，离心并移去上清，同样 方法洗涤细胞1 次 或 2 次 。如果需要，将细胞储存于一20°C 。 2 . 将细胞以I X IO8个细胞/m l 浓度重悬于T E N C 裂解缓冲液，再 加 入 1/10体积的含有 2 % 脱氧胆酸钠的T E N C 裂解缓冲液。涡旋振荡20〜30s，在冰上孵育15min。 3. 4°C ， 720g 离 心 5min，将 上 清 （含有细胞总蛋白）转移到一个干净的试管。如果需](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A14696974753448xfpzgmuvzpng_small.jpg)
![要 ，储存于一20°C 或一70°C 。 4 . 配 制 变 性 胶 （单 元 12. 3)，用 S D S /样品缓冲液稀释裂解液并进行变性。准备蛋白质 分子质量标准品，上样并电泳。如果需要的话，进行染色并拍照。 5 % 〜2 0 % 的 变 性 梯 度 肢 可 将 H I V 的 所 有 蛋 白 质 进 行 最 好 的 分 离 ，但 1 0 % 的变 性 肢 也 是 适 用 的 。 5 . 用转膜缓冲液将蛋白质从胶上电转移到硝酸纤维素滤膜上（单 元 12. 5)。 6 . 取出硝酸纤维素滤膜并放入一个玻璃器皿或一个仅比滤膜稍大一点的可密封的塑料 袋中。加 入 足 量 的 5 % 脱脂奶粉/I X T N 缓冲 液 ， PH 7 . 4 , 将 滤 膜完全浸没，室温 下 ，在平台摇床上温和地振摇30m i n 以上。 7 . 倒出缓冲液，用等量的p H 7. 4 的 T N -T N 缓冲液置换，振 摇 5min。 8 . 用新鲜配制的3 % (W V ) B S A /T N -T 缓 冲 液稀释抗H I V 多 克 隆 抗 血 清 （如高滴度 抗 血 清 按 1 : 100〜1 : 1000稀释）。移 去 T N -T N 缓冲液并用稀释的抗体溶液置换， 用量要足以将滤膜完全浸没。室温下孵育1.5h 。 多 个 供 应 商 有 针 对 H I V 的 单 克 隆 或 多 克 隆 抗 体 出 售 （如 见 Linscott’s Directory， 2001)， 或 者 将 已 知 含 有 相 对 高 滴 度 抗 H I V 抗 体 的 H I V 患 者 的 血 清 收 集 并 合 并 ，也 可 以 获 得 大 量 的 多 克 隆 抗 体 。 9 . 用 p H 7. 4 的 T N -T N 缓冲液洗涤滤膜2 次 ，再 用 p H 7. 4 的 T N -T 缓 冲液洗涤2 次 ， 每 次 5m i n 。 10. 将滤膜与含lfxl/ml [125I] 蛋 白 A 的 3 % B S A /T N -T 缓冲液在室温下孵育1〜3h 。 11.用 p H 7.4、 10m m o l /L E D T A /T N -T 缓冲液洗涤滤膜 3 次 ，用 p H 7.4 的 I X T N 缓 冲液洗涤1 次 。将滤膜在空气中干燥并用X 射光胶片曝光过夜](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B14696975062446ixqs5wzempng_small.jpg)
来源：丁香实验
