我要登录|
免费注册
|
我的丁香通
- 企业机构：
- 成为企业机构
- 个人用户：
- 个人中心
移动端

大家都在搜

大家都在搜

0 人通过求购买到了急需的产品

免费发布求购

点赞

收藏

分享

基本方案1 毛细管电泳的样品准备

相关实验：毛细管电泳法分析单链构象多态性实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	5'-FAM 荧光素标记的正向引物 5'-HEX 荧光素标记的反向引物
试剂、试剂盒	遗传分析仪缓冲液 Milli-Q 系列超纯水 MgSO4 10 X PCR 缓冲液去离子甲酰胺 DNA 大小标准品基因扫描胶 dNTP NaOH 甘油溶液琼脂糖凝胶 DNA 聚合酶
仪器、耗材	PCR 管聚丙烯管热循环器遗传分析仪

步骤

1.计算P C R 引物的理论Tm 值。用软件或通用的标准计算。用下面的退火温度： Tm (理论）一5°C 。 2. 准备5 个 25m l 的 P C R 反应体系，在冰水混合物中混合下列物质（乘以5): I. 25/J 20； xm〇 l/L 5卞A M 荧光素标记的正向引物（最终稀释为ljumol/L) 1.25pJ 2(V m d / L 5'H E X 荧光素标记的反向引物（最终稀释为 0 • (每种 10mmol/L ) dNTP (最终稀释为 200pmol/L ) 2. 54 10X P C R 缓冲液（最终稀释为I X ) 0. IjlJ 5U / W D N A 聚合酶（最终稀释为 0. 5U /25jul)。 3. 准备5 个 0.2ml P C R 管，在冰水混合物中将下列物质分别加入到标记的管中。 a. IjuI 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 17. 9/J milli-Q 系列超纯水，〇.5yl 25 mmol/L M g S O 4; b. Ijul 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 17. 4/J milli-Q 系列超纯水， I.Oyl 25 mmol/L M g S O 4; c. Ipl 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 16. 系列超纯水， 1. 54 25 mmol/L M g S O 4； d lpl 20〜 60叩 /4基因组 D N A ， 1 6 . milli-Q 系列超纯水， 2.〇 W 25 mmol/L M g S O 4; e. 1M120〜eOng/jul 基因组 D N A ， 15. 系列超纯水， 2. 54 25 mmol/L T MgSO4o 4. 加 5. 6 4 的 P C R 反应混合物到每个0. 2m l 的 P C R 管。制冷。保存在冰水混合物中。 5.用下面设定程序的热循环仪扩增D N A 片段。 1 个循环： 4min 94°C (变性） 34个循环： 20s 94°C (变性） 20s x°C (理论 T tn值一5°C ; 退火） 40s 72°C (延伸） 1 个循环： 7min 72°C (延伸）将热循环仪的盖子打开启动热循环仪，在热盖的温度>85°C 时，尽快将P C R 管从冰水浴中转移到热盖上。关上热循环仪的盖子。 6. 用 2 % 的琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析IOjUl P C R 产物（附录3G )，选择能够使正常片段大小的带清晰显现的MgSO4 浓度。 7. 准备48个 25jlJ P C R 反应体系。在冰水浴中混合下列物质： I. 25W ZOjumol/L 5卞A M 荧光素标记的正向引物（最终稀释为1/xmol/L ); I. 25^ 20/^mol/L 5 ' H E X 荧光素标记的反向引物（最终稀释为ljumol/L);

0.5/J (每种 10mmol/L) dNTP (最终稀释为 200jumol/L); 2. 5jl J IOXPCR缓冲液（最终稀释为I X ); 0. 5〜2. 5jnl 25mmol/L MgS〇 4 (最终稀释为〇.5〜2. 5mmol/L); 15. 9〜17. milli-Q系列超纯水； 0. Ipl 5U/jul Ptw DNA 聚合酶（最终稀释为 0. 5U/25/X 1)。混合好后，分装24jul到〇.2ml PCR管中，加 M 20〜IOOng 基因组DNA, 保存在冰中。 8 . 以第5 步设定好的温度用热循环仪扩增DNA片段。将热循环仪的盖子打开启动热循环仪，在热盖的温度>85°C 时，尽快将P C R 管从冰水浴中转移到热盖上。关上热循环仪的盖子。 9. 用 2 % 的琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析IOjul P C R 产物(附录 3 G ) 。 10. 将下列物质加人到50m l 聚丙烯管中： 3.56g 7 % 基因扫描胶； 5004 IOX带有EDTA或 T B E 的基因分析缓冲液； 2 8 7 ^ 8 7 % 甘油。 l l • 混合 l^ a P C R 产物（ 0 . 1 〜 0 .5 J u g / V lD N A ) 、 1 0 ^ a 去离子甲酰胺、 0 .5 J L a 0 .3 m o l/L N a O H 和 0. 5julD N A marker。 12.卩01产物在95°(：变性 5111丨 11，将混合物冷却至4°(： (或者变性后转入到冰水混合物中）。

来源：丁香实验

ad image

ad image

相关产品推荐

PR0G0TNP2密理博Progard TNP2预处理柱用于Milli-Q RiOs纯水系统

￥5737.27

RNA寡核苷酸退火缓冲液 (10×)，BioReagent, PCR试剂, 分子生物学级, 无RNA酶, 无菌, for DNA and RNA applications, 10X，阿拉丁

¥134.90

重组人 FAM3C / ILEI蛋白 (His 标签)

￥780

Bst DNA 聚合酶，大片段，无动物源, 无载体, 生物活性, 无DNA酶和RNA酶, ActiBioPure™, EnzymoPure™, 无菌, 8.0 U/μL，阿拉丁

¥209.90

小鼠cIAP2/BIRC3 qPCR引物对

￥399

相关方法

基本方案2 应用 ABI 310基因分析仪的自动化毛细管电泳

2024-05-13

基本方案3 应用ABI PRISM 3100基因分析仪的自动化毛细管芯片电泳

2024-05-13

相关问答

问

遗传分析仪3130中所说的多通道和多荧光指什么

1 回答 633 围观

推荐阅读

毛细管电泳的基本原理

毛细管电泳的介绍及基本原理

高效毛细管电泳（HPLC）的基本原理

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

丁香实验小程序二维码

领取干货资料

反馈

TOP

打开小程序