T细胞杀伤功能的检测

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

基本方案 1 抗 CD3 诱导的 T 细胞杀伤实验

材料

$靶细胞： E B 病毒（E B V ) 转化的 B 淋巴母细胞（A T C C : # 1 6 1 2 ; 单元 8. 16) n/ R P M I -5完全培养基 lmCi/ml Na2 [51Cr] O 4 (51 Cr^ 3 0 0 mCi/mg； Amersham) ' T 细胞（效应性细胞）：单个核细胞、 T 细胞或 T 细胞亚群（单元 8 . 3 或单元 7. 2)，来自正常非免疫个体抗 CD3 抗体（IgG2a) ，由 OKT3 腹水或培养上清纯化（单元 1 . 5 ) 或商品化试剂 (Ortho Diagnostic 或 Becton Dickinson) 2 % (V /V ) Triton X-100 2 4 孔平底细胞培养板（Costar) Sorvall离心机及 HlOOOB转子（或替代品） 9 6 孔圆底细胞培养板（Costar) 1 . 在 2 4 孔板各孔中加入 5 X IO5E B V 转化的 B 细胞，补充 RPMI- 5 完全培养基至 I .9ml。再加入 0•Iml 51Cr (IOOjuCi) ， 37°C标记 18〜24h。 2 . 收集标记后的B 细胞并加入离心管中。加入 IOml R P M I -5完全培养基，室温， 250g 离心 5min，洗涤细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞（附录 3 0 。用 R P M I -5完全培养基，调整浓度至5X 103个细胞/50/^1 (即 I X l O 5个细胞/ml)。 3•从IX lO 5个细胞/IOOmI 开始，用 R P M I -5完全培养基，将效应性 T 细胞进行至少 4 个浓度的系列稀释，起始效应细胞：靶细胞（effector : target， E : T ) 为 20 : 1。 4•从4Mg/m l 开始，用 R P M I -5完全培养基，将抗 C D 3 抗体进行至少5 个浓度的4 倍系列稀释。 5 . 在 9 6 孔板各孔中，加入 50^1放射标记的靶细胞、 50^1不同稀释度的抗C D 3 抗体和 I O O W 不同稀释度的效应细胞，各组设 3 复孔。自发释放对照组只加入靶细胞（不加抗体及效应细胞）。使用单个核细胞进行实验时，应设置含靶细胞和效应细胞的对照组（不加抗体），即 N K 细胞杀伤活性对照组。在另一块 9 6 孔板中，设置最大释放对照组，其中加入 5 \ 1 0 3标记后靶细胞和 150/^12%1^1〇111-100，也设 3 复孔$