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构建基因组区域的长距离限制性图谱

相关实验：大范围限制性图谱：脉冲电场电泳实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	Agarose-embedded DNA 样品
试剂、试剂盒	BSA 溴化乙锭稀有的限制性内切核酸酶电泳缓冲液亚精胺盐酸琼脂糖乙酰化和去核酶处理 DNA 长度标准 10 X 缓冲液 TE 缓冲液载样液
仪器、耗材	100 mm petri 板脉冲发生器脉冲电场电泳设备适合限制性酶切温度的水浴带正电荷的尼龙膜

步骤

1. 将包埋在琼脂糖中的D N A 样品放置到一个petri板中，然后将其切成8 个大约25jnl 的小块（ l m m X 4m m X 6m m )，每块含大约3^g D N A ，要小心处理样品以避免损伤而导致条带扭曲。 2 . 将一个微量离心管置于冰上，将以下的物品混合（总体积为 IOOfjJ , 包括琼脂糖块）： IOjul IOX限制性内切核酸酶缓冲液； I O jlJ lmg/ml 乙酰化 BSA; 知 1 1 0 0 m m o l / L 亚精胺盐酸； 5 ( ^ 1 灭菌水。将一个琼脂糖块放置于反应混合液中，冰浴 5 m m 。 3. 加 15U 的稀有限制性内切核酸酶入内，混合，冰浴 60min 以使限制酶能扩散到琼脂糖基质中。 4 . 将管子置于合适的温度中（表 5 . 1 . 1 或产品说明）水浴 5 h 。对于 5(rc的反应温度

D N A 长度标准应散布于胶中以助于分析D N A 长度。 9. 小心地移动梳子，先将〇.5X T B E 缓冲液注满胶孔，用两个小胶铲将D N A 样品引入到胶孔中，其中一个放置样品，用另一个打开胶孔以使样品能滑进去（要确保胶块底部没有产生气泡，以免D N A 在移动过程中产生扭曲）。 10. 将胶放到P F G E 设备中，加入 2.5L 0.5X T B E 缓冲液，可将缓冲液预冷到10°C ，或采用制冷装置循环缓冲液，或将电泳设备置于冰箱中。 11. 盖上胶盒的盖子（如 Bio-Rad系统）后就自动接通电源。对常规的分离要求和系统而言，常采用5 V / c m 的电场强度， 90s的脉冲时间，电泳时间为48h (或参照设备说明书）。 12. 当分离电泳完毕，关掉电源，排掉缓冲液，将胶放置含O J y g A n l 的溴化乙锭溶液中染色2〜24h，染后拍照。 13. 将用 P F G E 分离的D N A 转移的带正电荷的尼龙膜上。为了从P F G E 获得的大片段 D N A 的最佳转移，可采用酸去嘌呤的步骤，采用变性转移液和紫外线切割。 14. 将膜与用放射元素标记的探针杂交及放射自显影。使用没使用重复元件和载体序列的探针（或者与未标记的基因组D N A 预先退火，阻断它们的杂交)。支持方案1 制备包埋有高分子质量的哺乳动物细胞基因组 DNA的琼脂糖块此方案适用于大部分来源于哺乳动物细胞的活细胞，因为这些细胞能制成单细胞悬液，也可用于将组织解离而得到活细胞。尽量不要使用冻存的细胞，除非没有其他的 D N A 来源，因为冻融的过程会影响样品的质量。材料（标V 的条目参见附录1) 1.0% (m /V ) 低熔点胶，置于 H B S S 中哺乳动物细胞 V H B S S , 37〇C V 细胞裂解液 V T E 缓冲液 V P M S F /T E 洗涤缓冲液（新鲜配制） 50°C和 42°C水浴阻隔模子（如 Bio-R a d 的阻隔模子，许多 P F G E 系统都能提供） Beckman G P R 离心机（带有 GH-3. 7 的转子） 1•将装有适量的1 . 0 % 的低熔点琼脂糖胶的管子放到装有一半水的烧杯中，加热烧杯刚好达到溶解低熔点琼脂糖胶的温度，注意要确保琼脂糖中的水不丢失，溶卜将其置于50°C的水中降温。 2 . 用 7 0 % 的乙醇清洗阻隔模子，组装好后，然后将其置于碎冰中预冷（也可见产品手册)。 Bio-R a d 的阻隔模子能形成容量为 225jlJ 的股孔，按基本方案中介绍的方法切成 l m m X 4m m X 6m m 的胶块。每一胶块约含 3j L t g D N A 。对于四倍体或多倍体的细胞，就要根据实际情况调整到 SjUg D N A ，而不能过量。

3 . 室温 150g ( B e c k m a n G H -3. 7 转子： 800r/m i n ) 离心 8m i n 收集細胞。弃上清，用 IOml 37°C 的 H B S S 重悬细胞，混匀后制成单细胞悬液。用血细胞计数器对|田胞计数 (附录31)。 4 . 用 H B S S 重悬、离心细胞来洗涤细胞2 次。计算出使细胞浓度达到4 X IO7个/m l 的细胞重悬体积。用比计算出的体积稍微少一点的H B S S 重悬细胞，将其小心吸人另一个管子中，测量其实际体积。然后补加H B S S 至所计算出的体积。 5•将已融的琼脂糖从50°C 水浴移到42°C 水浴（不需严格平衡）。将装有细胞的管子也置于 42°C 水浴，加人相词体积的 42°C 的琼脂糖，混合。将细胞/琼脂糖悬液置于 42°C 。 6 . 吸取225|u l 的细胞/琼脂糖悬液至每一个已预冷的阻隔模子中。可将模子置于冰上 5m i n 固化。用两个小铲将胶块移到装有20m l 细胞裂解液的管子中（足够放入I0 个 225|u l的胶块）。将其置于50°C温育 24h 。 7. 倾弃裂解液，再加入20m l 的新鲜的裂解液，在 50°C 再温育24h 。 8. 透析胶块2 次，每一次使用40m l T E 缓冲液，室温， l h 。轻柔地翻转几次管子。最后一次是在50°C 中按同样的方法透析。 9. 用新鲜配制的P M S F /T E 洗涤液代替T E 缓冲液，然后置于50°C 中温育，重复一次。 10. 用 P M S F /T E 代替新鲜的T E 缓冲液，将胶块置于10°C 保存。支持方案2 用啤酒酵母染色体和Y A C 制备包埋在琼脂糖块中的高分子质量标准品啤酒酵母（ S .ceret^ ae) 拥有 16条长度从200〜2000k b 的染色体，这样为P F G E 提供了方便的D N A 长度标准。材料（标V 的条目参见附录1) 啤酒酵母（ S .cerehhae) 细胞 • VY P D 平板和培养基或A H C 平板和培养基 V 50mmol/L E D T A , pH 7. 5 7 0 % 乙醇 V S C E 缓冲液 Zymolyase 溶液： 100U/ml 的 Zymolase 100T ( 干粉； I C N Biomedicals) / 100mmol/L mercaptoethanol (2-M E)，溶于 SCE 缓冲液 2-ME溶液： 70mmol/L的 2-ME，溶于 SCE缓冲液 V 细胞裂解液 V T E 缓冲液 30°C温箱 30°C水浴摇床 250m l 离心瓶 Sorvall离心机，带有 G S A 转子（或相当的离心机及转子） 50m l 的圆锥形离心管，带螺旋式的管盖

树脂的阻隔模子（ Bio-Rad) 带 G S A 转子的Beckman离心机（或相当的离心机及转子） 42°C和 50°C水浴箱 1 . 取 S.cere心 — 菌种在Y P D 平板上划线以备挑取单克隆细胞。 30°C孵育 1〜 2d。如果要从携带Y A C 的酵母株中获得染色体，就用至少能筛选出一个Y A C 臂的培养基代替酵母培养基，如 A H C 平板和培养基用于带有U R A 3 和 T R P l 的 Y A C 。 2 . 挑取一单克隆至一个装有5 m l 的液体培养基的无菌管中，在 30°C通风良好的条件下培养过夜。 3•接种2m l过夜培养物到装在500ml灭菌瓶中的200ml培养基中，在 30°C通风良好的条件下培养过夜。 4 . 将培养物移到2 5 0 m l的离心瓶中，室温 5800g (相当于 Sorvall G S A 转子 6000r/ m i n ) 离心 IOmin,收集细胞。 5 . 用 15ml p H 7.5, 5 0 m m o l / L 的 E D T A 重悬细胞，然后移至一 5 0 m l 的圆锥形带螺旋盖子的离心管中，用细胞计数器计数细胞，用 5〇 m m o l / L 的 E D T A 进行稀释以调整细胞浓度。 6. 用 7 0 % 的乙醇清洗阻隔模子，组装好后，然后将其置于碎冰中预冷。 7 . 室温离心细胞， 900g (相当于 B e c k m a n的 GH-3. 7 转子 2000r/min) 。用适量的zym d y a s e 溶液重悬细胞，调整其浓度为4 X 1 0 9个/ml。 & 将 1. 4 % 的低熔点琼脂糖溶化后放入50°C的水浴中冷却。 9.取 Iml的细胞重悬液（4X 109个）到一 15m l 的管中， 42°C 水浴。加人Iml的已融的琼脂糖，混匀，继续水浴。 10. 将细胞/琼脂糖混合液加人置于冰上的阻隔模子中，放置 5 m i n 以固化。将模子中的胶块移到20m l 的 2- M E 溶液中， 37°C温育过夜。一个 225jul的胶块会形成一个 l m m X 4 m m X 6 m m 的样品块，细跑浓度为 2 X 1 0 9 个 /ml， D N A 的最终浓度约为 33哗 / 4 。 1I •^倾去溶液后换成3〇 m l的细胞裂解液， 50°C温育过夜。 12. 检查白色、不透明的胶块是否变得透明了（如变透明就说明大部分的细胞已裂解）。换成新鲜的细胞裂解液，继续放置50°C中温育过夜。 13. 裂解完毕后，往管中加满T E 透析胶块，每隔 30min至 I h 更换 T E ，总共透析4 次，最后往管中加满新鲜的T E 缓冲液，连同胶块保存于10°C。将胶块进行PF G E (见基本方案），电场强度： 5V /c m ，脉冲时间： 90s，电泳 36〜48h〇支持方案3 BAC D N A 的制备、限制性消化及电泳分析材料（标V 的条目参见附录1) V 加了抗生素的L B 培养基（抗生素浓度与培养细菌的固体培养基相同）取大肠杆菌（ E. D H lO B 在固体培养基上划线以挑取所要的B A C 克隆/抗生素/EPTG (25； zg/m l) /X-gaUSOpg/m l) ; 通常用于一般的B A C 载体的抗生

素的浓度是：氣霉素12. 5jug/ml，卡那霉素25yg/ml V G T E 溶液，冰上预冷 V N a O H / S D S 溶液 V 乙酸钾（potassium acetate ) 溶液异丙醇 7 0 % 的乙醇 • 7TE 缓冲液，pH 8.0 IOU/jlJ 的 i V o d 限制性内切核酸酶和缓冲液（ N EB) 100 X B S A (NEB) V 6X 载样液用 0. 5 % 的 T B E 配制的用于电泳的1 % 琼脂糖胶 D N A 长度标准（支持方案2) V 〇.5jug/m l 的溴化乙键 15ml 管 37°C的摇床温箱带有套桶转子的离心机 37°C水浴箱或温箱 Bio-Rad C H E F 部件（ D R -n 、 DR-EI或 M a p p e r),配有制冷器和泵紫外灯盒子 1 . 用一 15ml管装 3m l的有抗生素的LB 培养基，从 DHlOB的划线平板上挑取一单克隆至其中， 37°C摇床培养16〜18h (250r/min)。 2. I 77Og (相当于有套桶转子3OOOrAnin) 离心 lOmin，弃去上清液，加入 200^1在冰上预冷的G T E 溶液，重悬细菌，然后将其移人到一微量离心管中，加 4 0 0 4 的 N a O H / S D S 溶液入内，颠倒管子进行混勻，将管子置于冰上7min。 3 . 加 300W乙酸钾溶液入内，颠倒管子进行混匀，置于冰上 7min。以最高速度离心 20min。将上清液移至一新的1.5m l微量离心管中，如果还有残留的杂质，可再离心一次以去除杂质。 4 . 加 600jul异丙醇人内，颠倒管子进行混匀，置于冰上20m in。以最高速度离心25min 将 D N A 沉淀下来。移去上清液，然后加入 I m l 的 7〇%乙醇，以最高速度离心 15m in，完全去除7 0 % 乙醇，将管子置于层流通风橱中风干I h 或放置试验台上风干几小时。用 35^1 pH8. 0 的 T E 重悬 BAC D N A 。 5. 配制消化BAC D N A 的限制性酶切反应液，如需要可增加D N A 浓度。如需要提高消化能力，可将限制性酶的浓度提高到0.75〜lju l。缓冲液； 0. 2yX 100X B S A ； 0. 5jla1 10U /|u.l N o t I ； 7 . 8 ^ 灭菌水； 5. 0 B A C D N A ；总体积： 15jlJ 。

37 C酶切5h 以上。酶切完毕后加〇.2^J 的 6X 载样液以终止消化反应，在将甘加到 C H E F 胶中以前将其保存在冰上。 6. 用 0.5%的T B E 制备一 1% 的琼脂糖胶，置于50。〇左右冷却。当胶固化后，加 D N A 长度标准到胶中（支持方案2)，用融化的琼脂糖封住胶孔。 7. 加2. 5L 预冷（14 C ) 的 0.5X TBE到电泳槽中，将胶放入电泳槽中后，把酶切样品连同载样染料加入到浸没在TBE中水平摆放的胶中。电泳条件如下。切换时间 5〜15s，采用线性扫描电压，电场强度6V/cm(200V)，电泳时间1 5 h 。 8•电泳完毕后，根据基本方案中方法用〇.5jug/m l 的溴化乙锭染胶，在紫外光的盒中检测胶。当观测C H E F 胶时，插入的条带会较清晰，位于载体条带的上方，载体 pBe_ loBACll及其付生载体的大小为7. 5k b 载体的条带在所有的泳道中都应看得见。人类的B A C 中通常有一条超过IOOkb的插入条带，因为大部分人类B A C 平均的插入片段长度在IOOkb以上。 9 . 如何需要的话，可将股中的BAC DNA根据Southern blot的方法转移，然后与探针杂衮（基本方案中第13和 14步)。

来源：丁香实验

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