最新修订时间：2024-05-13
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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![55s 52°C+0.2°C/循环 (用梯度退火) 30s 720C (延伸） 5 个循环： 30s 95〇C (延伸） 55s 58〇C (退火） 30s 72〇C (延伸） 1 个循环： 7min 72〇C (最后延伸） 最后~~^步： 无限期 4°C (保持) 5•在前PCR清洁的房间里，为每个基因组DNA样本准备和标记第二组24个扩增反应 管并为28个反应准备足够的标记的PCR主要混合液n , 混合液无金牌Ampli T叫 酶 （ 表 2. 4. 2)，漩涡彻底混勻。 6•在P C R 阶段房间里立即加金牌Ampli Tag 酶到标记好的P C R 管里，分 装 22. 5|u l的 完全的主要混合液n 到新的标记好的管子/板 子 中 （ 第 5 步） ，将管子转移到主要实 验室的低拷贝的区域（ 远离热循环仪） 。 7. 用 1.0m l 的分子级水（ 无核酸酶的）装 满 96X Im l深孔微量滴定板的24个孔。 为 了 减 少 P C R 的 交 叉 污 染 ， 可 以 在 前 P C R 清 洁 的 房 间 里 用 水 装 满 一 个 深 孔 微 量 滴 定 板 ， 用 铝 箔 盖 子 盖 好 ，再 拿 到 主 要 实 验 室 。 8. 继续完成多重P C R 反 应 （ 第 2 步） ，带旋转桶的离心机上低速（ 大 约 Iooog) 离心多 重 P C R 反应板。 9. 在主要实验室的中拷贝区域，小心地移去管子的盖子，用 一 个 1〜10]^的多道移液 器和相应的tip，加 I .O 1 ^l 的 24个多重扩增反应液到装有水的板子中，用铝箔盖子紧 紧地封好孔，轻轻地漩涡混匀、离心。 1 0 . 在主要实验室的低拷贝区域，用一个1〜l〇 y 的微量移液器（ 最好的多道 的 ）分装 2. 5^1的 1 : 1000的 稀 释 液 （ 第 9 步）到标记好的装有PCR主要混合液n (第 6 步）的扩增管子/板子中。用盖子封好管子，离心。 11. 用下面的程序在热循环仪上开始标记好的PCR扩 增 反 应 （ 为 M J和 Perkin-Elmer 热循环仪优化)。 起始步： 8min 95°C (变性) 4 0 个循环： 30s 95°C (延伸） 90s 55°C (退火） 30s 72°C (延伸） 1 个循环： 7min 72°C (最后延伸) 最后一步： 无限期 4°C (保持） 12. 可选：为了确认P C R 扩增反应，在主要实验的高拷贝区域，每个反应取L5jul在 0. 4 % 的 NuSieve琼 脂 糖 （ 附录3 G ) 上分析。 所 有 的 2 4 道 都 应 该 看 见 大 约 IOObp 的 带 簇 。 13. 在主要实验室的高拷贝区域，每个PCR产物取23/J ，在两个微型-10微型集中器中 混合，室 温 13 O O O g 微 量 离 心 20min，或者直到量减少到至少1〇 倍 （ 总量小于 6〇 W)。通过反转过滤器重新获得样本， 3 000g■微量离心3min，混合浓缩物，通过 加水调整量到60W。取出3〇4用于杂交，其他保存在一2CTC](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469517547928zvpiyetv8gpng_small.jpg)
