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扩增和分析 DNA 池实验

相关实验：利用 DNA 池技术进行纯合子定位实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	Rain-X (UNELKO)10 X 储存缓冲液 Taq DNA 聚合酶 Binding solution 短串联重复多态引物（STRP)TE 缓冲液 4dNTP 混合液轻矿物油去离子甲酰胺载样缓冲液
仪器、耗材	热循环仪 96孔 PCR板 0. 5ml 离心管变形聚丙烯酰胺凝胶电泳仪器

步骤

1.根据吸光光度值将每个个体的DNA用 T E 缓冲液稀释到lOOng/jul，然后再测一次以确保样品浓度为lOOng/julilO ng/jul。 2. 利用一对或者两对STR P引物对每个DNA样品进行PC R 扩增，以确保所有样品都等量扩增。 3. 把等量的患者DNA混合在一起，每个个体2/xg溶解在20/J 水中（这些足够完成一次 IOcM密度的基因组扫描），这样得到lOOng/^l 的浓度（这里是总体的DNA 浓度，不是每个个体的DNA浓度），然后通过加人4 倍体积的水稀释到20ng/jul。 4. 用同样的方法将正常对照的DNA样品混合在一起，同样稀释到20ng/ V l。 5. 将不同的DNA池中的样品2 4 (40ng) 加入到单个的孔或者0.5m l的离心管中。如果对所使用的STRP引物的等位基因模式不熟悉，可以通过增加一个对照：加入一个个体的20ng D N A 以便于解释DNA池的等位基因模式。 6•处理好包含每对引物浓度为I .25pmol/L 的引物混合物（如果STRP扩增的片段大小不重叠，那么可以把两对或者多对引物放在一起进行扩增）。 7. 准备 PCR体系（对于 96个反应）： 10 X 储存缓冲液IOOjLtl; 2. 0mmol/L 的 4dNTP 混合液 125jnl; ddH20 3^5^1; • 5|ul 5U/jul 的 Tag DNA 聚合酶。 8. 将上述的PCR溶液加入6/J 到 96孔板的孔中，每个孔中还有D N A 和 STR P引物，共有如果热循环仪没有热盖则在每个孔中加入轻矿物油，按照下述条件进行 PCR扩增。预变性: 94〇 C , 3min 35 个循环： 94°C ， 30s 55°C , 30s 72。。， 30s 9. 准备好用来进行聚丙烯凝胶电泳的玻璃板，用 Rain-X 或者 Sigmacote处理长胶板，用结合溶液处理短胶板。 10. 准备6 % 的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺和双丙烯酰胺之比为19 : 1 ; 附录3F)，等胶聚合后，以 60W 预电泳10min。 11. 上样前，将样品用水浴或者95°C 热激 3min，然后马上置于冰上，每孔点样量为 4 4 , 患者和对照的样品交替点样以方便比对等位基因模式，恒功率 60W 电泳 Ih 45min〇 12. 银染（单元 2 . 1 ) 和通过比较患者和对照的胶图得到结果。牢记以下几点已得到正确的与疾病基因连锁的STRP

a. 考虑遗传模式。 DNA池技术对于患者来源于共同祖先从而可能在疾病位点纯合的常染色体隐性遗传病最为适用。在这种情况下，在和疾病位点紧密连锁的 STRP标记出，在患者DNA池中，应该只看到一种优势等位基因。 b . 考虑家系结构。在标记和疾病基因位点之间的重组会根据重组事件所处的位置导致患者DNA池出现不同的等位基因模式。例如，在一个父母是一级表亲的核心家系中，发生在父母和一个后代之间的重组事件会产生一个占绝对优势的等位基因和另一个等位基因（这个等位基因只在一个个体内出现）。然而，如果重组事件发生在上一代之间，那么就会导致在患者DNA池中出现两种等量的等位基因，因此对于一个给定的家系，考虑好等位基因的模式是很重要的。 c. 考虑与之邻近的标记数据。如果一个标记与疾病基因连锁，那么与之邻近的标记应该会有提示性的信息。一组提示连锁的标记远比一个提示连锁的标记说明作用大。 d. 识别没有信息含量的标记。在对照中指出现一种条带的标记是没有信息含量的。一次基因组扫描没能鉴定出连锁区域，应该使用该标记附近的其他STRP进行分析。

来源：丁香实验

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