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        免 疫 球 蛋 白 M(IgM)和 免 疫 球 蛋 白 D(IgD) 的纯化

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        基 本 方 案 1 用透析和凝胶过滤层析法纯化 IgM

        此 法 纯 化 的 IgM 可达到较好纯度,可用于酶解、异 硫 氰 酸 盐 荧 光 素(FITC) 标记 、生物素标记或放射性标记。

        材 料(带 V 项 目 见 附 录 1)

        腹 水 或 单 克 隆 抗 体(MAb) 上 清(单 元 1.4)

        PBS

        Sorvall离心机, SS-34型 转 子(或类似转子)

        透析袋

        26 mmX900 mm 层析柱,填有适当凝 胶 过 滤(SE) 树 脂(CPI 附 录 31)

        1.单 元 L 5 离心和去除IgG中脂类物质的方法纯化腹水上清,若 是 M Ab上 清 ,室温或 4℃, 15 000g离心30min,去除细胞碎片,保留上清。

        2.将澄清的腹水或MAb上清转至透析袋中,在 4°C 下用≥1 0 倍样品体积的蒸镏水透析24 h,在室温或4°C下将透析好的溶液以 15 000〜20 OOOg 离 心 lh ,弃去上清。

        3.将填有 SE 树 脂 的 26 mmX900 mm层 析 柱 用 PBS 平 衡(CPI附 录 31),用≤5 mlPBS溶解步骤 2 中的沉淀并上样,用 PBS 洗脱蛋白质并收集 100 个 组 分(1 % 柱体积)。

        4.测 A280。值 确 定 IgM 浓 度(表 1.5.1)。将含有纯 IgM 的 洗 脱 液 合 并(第一个洗脱峰)。用 1 0 % SDS 还原聚丙烯酰胺凝胶鉴定 IgM 纯 度(单 元 12. 3)。视使用的凝胶装置而定上样量,为 1〜80ul。电泳上 IgM 显示二条带,在 78kDa 处 的 重 链 带 和 25kDa 处的轻链带。

        5.溶于 PBS 中浓度为 1〜20m g/m l 的 IgM 可 于 4°C 或 一 70°C (不能冻融)保 存 数 月 ,若 IgM 出现沉淀,可用更髙离子浓度的缓冲液再溶解(如 加入 NaCl)。

        来源:丁香实验

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