材料与仪器
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 |
步骤
一、位点特异性生物素标记的 DNA 衍生片段的设计及预备
1.化学反应
2.酶反应
![用 12]ul H 2◦ 重 悬 5 p m o l 寡聚脱氧核苷酸衍生物，加入： 2沁 I O X 磷酸化缓冲液 5^1 [7 -32p ] A T P (I . 8 5 X 1 0 6B q, gp 50^Ci) Ijul ( I O U ) 的 T 4 多聚核苷酸激酶 37°C孵育 3 0 m in。 要点：这一步骤及以后的操作步骤，都需在暗光条件下完成。必须避 免 荧 光 和 日 光 照 射 ，可 采 用 低 等 或 中 等 的 发 热 光 源 （ 如 60W 钨灯 泡灯）。 ㉕ 加 入 2〇 W H 2◦ ，充分混匀。 @ 根据操作说明，用 C H R O M A S P I N + T E -lOspin柱 ，用 T E 对放射性标记的 .寡聚脱氧核苷酸衍生物脱盐，然后立即进行下一步操作。必要的话，可以将其在暗处 保存于一20°C ，但不能超过24h 。 ㉘ 在一支硅化过的I.5m l 小离心管中加入： 40沁放射性标记的寡聚脱氧核苷酸衍生物 1 4 1 0 y m o l/L 的上游引物 4pl 0 •5ymol/L 的单链D N A 模板 5沁 10X 退火缓冲液 65°C加热 5m in。 ⑳ 将 管 子 放 人 一 个 600m l 体积的烧杯中，内盛有400ml 65°C 的 H 2O , 在室温下 渐 渐 冷 却 （ 在 约 6〇 m i n 内 从 65°C 降 到 25°C )。 ⑩ 加 入 ： 2 //1 D N A 聚 合 底 物 （ d A T P 、 d G T P 、 dCTP 和 dT T P 各 2 5m m ol/L ) Ijul 10 0m m o l/L A T P 0 .5 y l (IO U ) T7 D N A 聚合酶 Ipd (3 U ) T 4 D N A 聚合酶 lpd (5 U ) T4 D N A 连接酶 1^1 (l^g/m l) 单链结合蛋白 冰上孵育 5 m in ， 然后在室温下孵育5 m i n ,接 着 在 37°C孵 育 lh。同时 做一个不加入连接酶的“ 无连接酶”平行对照](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469426333165tgggkwtesypng_small.jpg)
二、蛋白质-DNA 复合体的制备及紫外照射
1.轻轻摇动存储瓶，重悬顺磁性小磁珠。取出 3u1 的溶液转入一个硅化过的 1.5 ml 小离心管中，低速离心。
2.将管放入磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。
3.用 30jullX 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，用一微量吸管轻轻混勻，室温孵育磁珠 2 min。
4.低速离心。
5.将管放人磁性粒子收集器中，静置 30s 后去上清，重复步骤③?⑤。
6.用 10ul 2X 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，加人 2ul 60nmol/L 生物素标记的位点特异性 DNA 片段衍生物（从本方案 7.1 中步骤48获得）。25℃ 孵育 10 min，不时轻轻敲打管子以混匀液体。
7.将管子放入磁性粒子收集器中，静置 30s 后，将上清转入一支新的硅化的 L5 ml 小离心管中。
8.通过比较磁珠和上清的放射量来估算生物素标记位点特异性 DNA 片段衍生物的结合产率，若结合产率大于或等于 80%，可继续以下操作，若产率未达要求，则需从本方案 7.1 中步骤25 开始重复操作。
要点：这一步及以后的操作步骤都需在暗光条件下完成。必须避免荧光和日光照射，可采用低等或中等的发热光源（如 60W 钨灯泡灯）。
9.用 30ul 1 X 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，低速离心。
10.将管放人磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。
11.用 30ul l X 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，低速离心。
12.将管放人磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。
13.用 1 X 蛋白质结合缓冲液重悬磁珠，使 DNA 达到预定浓度，加入预定浓度的蛋白质，在合适的温度下，经合适的时间孵育混合液，孵育过程中不时轻轻敲打管子侧壁，以使液体充分混匀。
在这一步及下面的操作中，DNA 和蛋白质的浓度、反应的温度和时间都根据以往的经验进行设定，或是根据已知的复合体内各组分相互作用的知识来确定。
14.低速离心。
15.将管放入磁性粒子收集器中，静置 10s 后弃上清。
16.用预先孵育到合适温度的 50ul 1 X 蛋白结合缓冲液，重悬磁珠，在合适的温度下孵育 2 min。
17.将管子放人磁性粒子收集器中，静置 30 s 后弃掉上清。
任选：在这一步里，可以加入增强子、抑制子或效应分子（见 Kim，etal，2000a;Naryshkin，etal，2000)。
18.用预先孵育到合适温度的 20ul 1 X 蛋白结合缓冲液重悬磁珠，将混合液转入一支聚苯乙烯小离心管中，而后将管子插人一支预先孵育到合适温度的 13mmX100mm 的硼硅酸玻璃培养管中。
19.将管子放人光化学反应发生器中，用紫外线照射蛋白质 DNA 样品 20s(11ml/mm2 于 350nm)。
如果所需的反应温度高于或低于周围环境的温度至少 10°C 的话，可在硼硅酸玻璃培养菅中注满 H2O, 而后对其进行预孵育，直至 H2O 的温度达到合适的温度为止。
20.将悬液转入一支硅化的 1.5 ml 小离心管中，加入 7ul 的终止反应溶液，振荡混匀。
21.将管放入磁性粒子收集器中，静置 10 s，取出 17ul 的上清，立即进行第三部分的操作。
三、核酸酶消化
四、发生交联反应的蛋白质的鉴定
![① 将 所 有 的 样 品 （16沁，从 本 方 案 7. 3 中步骤②获得）加到聚丙烯酰胺平板胶 加样孔中，在旁边的上样孔中，加 5沁预染色蛋白分子量标准。 ② 以 25V /c m 的电压，在 S D S 电泳缓冲液中进行电泳，直至溴酚蓝迁移至胶的 末端为止。 ③ 取下胶后将胶干燥，进行放射自显影或磷屏曝光。 实 例 研 究 ： E .coG R N A 聚 合 酶 转 录 起 始 复 合 体 本方案已成功地用于分析E1.coZz R N A 聚合酶转录起始复合体（ Naryshkin, e t a l ， 2000, 2 0 0 1 ; 未发表）。研究结果已用于分析R N A 聚合酶启动子开放复合体的结构组 成 （ R P O ; Naryshkin, e t a l ， 2000)、 R N A 聚合酶-启动子开放复合体形成的过程中可 能存在的一种媒介物的结构分析（ R P ]5t; N N aryshkm ， e t a l， 未发表），以及转录増 强子对RP◦ 和RPist.结构组成影响的分析（ Naryshkin， e ta l， 2 0 0 0 ; 未发表）](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469426469951mf85u9z44mpng_small.jpg)
来源：丁香实验
