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        十字交叉连续稀释分析法测定试剂最适浓度

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        从该分析法得到的结果（图 1.1. 7 ) 可用来调整在基本方案和备选方案中用到的试 剂最适浓度。 附 加 材 料 （其他材料见基本方案) 包被试剂 第二反应试剂 显色试剂 17mmX IOOmrn 和 12mmX 74mm 试管 1 . 置 4 支 17mmX100mm试管于试管架，后 3 支试管中加入6mlPBSN。试 管 1 中配制 浓 度 为l 〇/xg/ml包被试剂的PBSN 12ml。从 试 管 1 中 吸 取 6m l溶 液转移至试管2。 用移液管将试管2 中的溶液吸上吹下混勻5 次 。重复溶液转移和混勻至试管3 和 4; 此 时 从 试 管 1 到 试 管 4 包 被 试 剂 浓 度 分 别 为 10Mg/ml、 5Mg/ml、 2.5iug/m l和
        图 1.1. 7 抗体-夹心ELISA检测抗原的十字交叉连续稀释分析法结果（针对第二和第三反应 试剂浓度的优选）。列 1〜11和行B〜G 的数字代表在96孔微量滴定板上的每个孔所能观察到 的相关荧光单位。反应试剂浓度决定于由研究者设定的单项检测变化。如果显色的时间设定 为 lh，相关荧光约为1000相关荧光单位，同源抗原的敏感性为780pg/ml, 在酶联免疫吸附 试验中用浓度为500ng/ml的酶标抗体。如果试验需要检测到仅仅3,12ng/ml的同源抗原，那 么复合物的浓度就应被降低到125ng/ml。应当注意比较同源和异源的反应（孔 B5 对 B ll和 D4 对 D10)，这对于该试验中特异性和信噪比都是相当有利的。 L 25fig/ml0 2 . 用多道移液管吸取50^1包被液至4 个 Immulon微量滴定板孔板中（即每一板中加入 一种稀释度的稀释液）。室温下孵育过夜或37°C下 孵 育 2h。 3 . 用封闭缓冲液洗涤板，并 封 闭 板 （见基本方案，步 骤 4〜 5) 。 4 . 置 5 支 12mmX75mm试管于试管架，后 4 支 试 管 中 加 入 3m l封 闭缓冲液。试 管 1 中，准备浓度为200ng/m l第二反应试剂的PBSN4ml (对于极不敏感的检测可改用 浓 度 为 l 〇〇〇ng/ml)。从 试 管 1 中 吸 取Im l溶液转移至试管2。用移液管将溶液吸上 吹下重复5 次 。重复溶液转移和混匀至试管3〜5 ; 此时试管内第二反应试剂的浓度 分别为 200ng/ml、 50ng/ml、 12. 5ng/ml、 3.12ng/ml 和 0. 78ng/ml。如需要，配制 并平行比较具有与包被试剂无反应性、异源形式的第二反应试剂的连续稀释液。 5 . 吸 取 第 二 反 应 试 剂 溶 液 50/x l加 入 前 5 列 微 量 滴 定 板 孔 板 中 ，第 5 列浓度为 0.78ng/ml，第 1 列 为 200ng/ml。 4 块包被板同样加样。室温下孵育2h。 6• 洗 涤 （见基本方案，步 骤 7)。 7 . 置 5 支 17mmX100mm试管于试管架上，后 4 支试管中加入3ml封闭缓冲液。试 管 1 中，用封闭缓冲液配制500ng/ml显 色 剂 6ml。吸取试管1 中溶液3ml转移至试管2, 混匀。重复溶液转移和混匀至试管3 和 4 。此时试管中显色剂浓度分别为500ng/ml、 250ng/ml、 125ng/ml、 62. 5ng/;ml 和 3L 25ng/ml〇 8 . 吸 取 50M 1显色剂至2〜6 行的每一微量滴定板的孔中，把最大稀释程度的溶液加入第 6 行孔中。 4 块包被板同样加样。室温下孵育2h 后洗涤。 9 . 加 入 75/xl MUP或 NPP底物溶液至每孔中，室温下孵育lh ，目测显色程度或用微量
        滴 定 板 检 测 仪 定 量 测 定 （见 基 本 方 案 ，步 骤 9)。测 定 结 果 ： N PP作 底 物 时 ，在 4 0 5nm处 应 为 0. 5 0 吸光单位/h; MUP作底物时应为1 0 0 0 〜1 5 0 0 荧光单位/h。 表I.I.1 酶联免疫吸附试验总结 ELISA 用途 需要的反应试剂 评价 间接 抗体筛选 表位定位 纯化或半纯化的抗原；含有抗体的测试液； 连接有免疫动物免疫球蛋白的酶复合物 不需要使用预存的特异性抗体；需要 相对大量的抗原 直接竞争 抗原筛选；检 测可溶性抗原 纯化或半纯化的抗原；含有抗原的测试液； 针对抗原特异性的酶-抗体复合物 只需2步的快速检测；极好地测定抗 原的交叉反应性 抗体夹心法 抗原筛选；检 测可溶性抗原 捕 获 抗 体 （纯化或半纯化的特异性抗体）； 含有抗原的测试液；针对抗原特异性的酶- 抗体复合物 最灵敏的抗原检测；需要相对大量的 纯化或半纯化的特异性抗体（捕获抗 体） 双 抗 体 夹 心法 抗体筛选 表位定位 捕获抗体：已免疫的种属特异性的免疫球蛋 白；含有抗原的测试液；针对抗原特异性的 酶-抗体复合物 不需要纯化的抗原；检测过程相对 长 ，需 5个步骤 直接细胞 筛选细胞的抗 原表达；检测 细胞抗原表达 表达感兴趣的抗原的细胞；针对细胞抗原特 异性的酶-抗体复合物 大量筛选的灵敏检测；对检测混合细 胞表达的异质性不灵敏 间接细胞 筛选针对细胞 抗原的抗体 用于免疫的细胞；含有抗体的测试液；连接 了已免疫的种属的免疫球蛋白的酶复合物 当细胞表面抗原表达处于低密度时可 能无法检测出特异性抗体

        来源：丁香实验

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